細(xì)胞工程花藥和花粉培養(yǎng)

細(xì)胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第1頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二主要內(nèi)容7.1花藥培養(yǎng)7.2花粉培養(yǎng)7.3花藥和花粉培養(yǎng)中的白化苗問題7.4操作實(shí)例第2頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二植物花藥/花粉培養(yǎng)歷史

Guha和Maheshwari（1964）曼陀羅花藥培養(yǎng)Nitsch和Norreel(1973)煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)）

Chu（1973）小麥花粉培養(yǎng)（早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低）

80年代后期到90年代期間，花培技術(shù)迅速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等。

90年代，一些先前被認(rèn)為是不易進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù)成功Konzak(1999)。第3頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二花粉和花藥的區(qū)別兩者的異同點(diǎn)1.培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。2.花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培3.花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾，可計(jì)數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；能觀察雄核發(fā)育的全過程，單倍體產(chǎn)量高。但技術(shù)更復(fù)雜。第4頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二花粉和花藥的培養(yǎng)作用1、作物育種（1）縮短育種周期：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。供體植株小孢子（n）花粉植株（n）加倍純合植株DH（2n）花培雄核發(fā)育自然加倍人工一年內(nèi)獲得純系第5頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率

例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因?yàn)锳Abb的純合單株常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb區(qū)分開。ABAbaBabABAABBAABbAaBBAaBbAbAABbAAbbAaBbAabbaBAaBBAaBbaaBbaaBbabAaBbAabbaaBbaabb第6頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二（3）誘變育種中的作用植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當(dāng)代及時(shí)獲得突變個(gè)體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。

第7頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二花藥離體培養(yǎng)的過程：

第8頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二7.1花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)：是指把發(fā)育到一定階段的花藥接種在適宜培養(yǎng)基上，使其中的花粉發(fā)育成單倍體植株的過程。花藥培養(yǎng)過程的主要環(huán)節(jié)：1、選取花粉單核期的花蕾和幼穗；2、進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理；3、對(duì)外植體進(jìn)行表面消毒；4、無菌條件下取出花藥接種到合適的培養(yǎng)基上，在適宜的條件下培養(yǎng)；5、花粉胚或花粉愈傷組織發(fā)育到適宜階段后，轉(zhuǎn)入植株再生培養(yǎng)基形成花粉植株；6、在試管苗階段或移栽成活以后進(jìn)行花粉植株的染色體加倍；7、煉苗，移入土壤栽培。第9頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二一、材料的選擇花藥外植體的選擇是否合適，直接關(guān)系到培養(yǎng)能否功。第10頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二1.供體植株的基因型材料的遺傳背景對(duì)花藥培養(yǎng)的影響很大，不同植物甚至不同品種之間對(duì)花藥培養(yǎng)的反應(yīng)都有差異，因此選擇合適的品種常是培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素。如水稻中粳稻比秈稻容易培養(yǎng)。第11頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二2.供體植株的生理狀態(tài)供體植物生理對(duì)誘導(dǎo)頻率有直接影響。如多年生植物中，幼年植物比老齡植物的花藥誘導(dǎo)頻率高；草本植物中生長健壯的花藥誘導(dǎo)頻率較高；煙草開花早期的花藥比后期的更容易產(chǎn)生花粉植株；供體植株的生長條件對(duì)花粉發(fā)育及其對(duì)離體培養(yǎng)的反應(yīng)也有重要影響。第12頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二3.花粉的發(fā)育時(shí)期不同植物的花粉對(duì)離體培養(yǎng)有其特定的最敏感發(fā)育時(shí)期，因此，選擇發(fā)育到合適時(shí)期的花粉是提高花粉植株誘導(dǎo)頻率的重要因素。例如煙草和水稻的花粉從單核早期至雙核期都可接受誘導(dǎo)；小麥和玉米處于單核期的花粉培養(yǎng)效果最好；而天竺葵則從四分體的花粉得到最佳效果。對(duì)于大多數(shù)植物來說，單核期的花粉比較容易培養(yǎng)。第13頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二發(fā)育時(shí)期物種減數(shù)分裂時(shí)期草莓、番茄種四分孢子期葡萄單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期煙草單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍(lán)四分孢子期至雙核期玉米不同物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時(shí)期第14頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二檢查花粉的發(fā)育時(shí)期的方法：染色法：如用醋酸洋紅等染色制片，然后在顯微鏡下觀察。水稻單核靠邊期鑒定第15頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二二、預(yù)處理在花藥接種之前，先對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理可以提高誘導(dǎo)率。預(yù)處理方法：1.低溫預(yù)處理：一般可將帶有葉鞘的穗子（如稻、麥類）或花蕾（如煙草、油菜等）用紗布包裹后再用塑料袋套起，放在冰箱中預(yù)處理。2.高溫預(yù)培養(yǎng)：在花藥分離后，把培養(yǎng)物放置在較高溫度條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，然后再轉(zhuǎn)移到常溫條件下繼續(xù)培養(yǎng)。3.甘露醇預(yù)處理將大麥的花藥用過濾除菌的0.3mol/L甘露醇溶液預(yù)培養(yǎng)3-5天，然后轉(zhuǎn)移到過濾除菌的FHG液體培養(yǎng)基上漂浮培養(yǎng)，其中的小孢子散落到培養(yǎng)液中形成大量的花粉胚。4.其他方法：離心預(yù)處理、乙烯利預(yù)處理、PEG預(yù)處理及磁場預(yù)處理第16頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二三、培養(yǎng)基培養(yǎng)基的組成對(duì)花藥培養(yǎng)的成功率有明顯的影響。1.植物生長物質(zhì)：不同植物甚至不同品種之間對(duì)生長物質(zhì)的需求都有可能不同。2.碳源：大部分培養(yǎng)基中使用的碳源都是以蔗糖來提供的，同時(shí)它還起著調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透勢的作用，不同植物及不同培養(yǎng)階段對(duì)蔗糖濃度的要求不同。3.其他成分：基本培養(yǎng)基中各無機(jī)成分對(duì)花藥的離體培養(yǎng)中愈傷組織的產(chǎn)生有較大的影響。第17頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二四、培養(yǎng)方式1.液體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：可以用過濾法除菌，其中生物活性物質(zhì)不會(huì)因常規(guī)的高壓滅菌而破壞，因此比在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果更好。缺點(diǎn):液體培養(yǎng)容易造成培養(yǎng)物通氣不良，特別是隨著愈傷組織重量的增加，容易沉到培養(yǎng)基底部，由于供養(yǎng)較差，可能會(huì)對(duì)愈傷組織的分化能力產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。第18頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二2.雙層培養(yǎng)：固體-液體雙層培養(yǎng)基制作的方法是先在35mm×10mm的小培養(yǎng)皿中鋪1-1.5mL瓊脂培養(yǎng)基，待固化后在其表面再加0.5mL液體培養(yǎng)基，然后將花藥接種在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。雙層培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是花藥在培養(yǎng)早期可以從活性高的液體培養(yǎng)基汲取營養(yǎng)，花粉胚長大后不會(huì)沉沒?？梢栽谕饬己玫臈l件下分化成植株。第19頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二3.花藥-花粉分步培養(yǎng)：先將花藥接種在液體培養(yǎng)基（含F(xiàn)icoll）上進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，花粉可以從花藥中自然釋放出來，散落在液體培養(yǎng)基中。及時(shí)用吸管將花粉從液體培養(yǎng)基中取出，植板于瓊脂培養(yǎng)基上，使其處于良好的通氣環(huán)境中，可使花粉植株的誘導(dǎo)率大大的提高。第20頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二4.條件培養(yǎng)利用條件培養(yǎng)基，即預(yù)先培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基進(jìn)行花藥培養(yǎng)，可使花藥培養(yǎng)效率大大提高。第21頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二五、培養(yǎng)條件1.溫度：離體花藥對(duì)溫度的敏感性比較高。2光照：不同植物對(duì)光照的要求不同。第22頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二六、花粉植株的倍性及染色加倍花藥植株的倍性：花藥培養(yǎng)中，由花粉發(fā)育成的花粉植株并不像所期望的那樣全是單倍體，其中不但有二倍體還有多倍體和非整倍體?；ǚ壑仓曛谐霈F(xiàn)自然加倍主要是由于核內(nèi)有絲分裂造成的，核內(nèi)有絲分裂與接種花粉的時(shí)期、培養(yǎng)基中植物生長物質(zhì)的種類和水平、花粉植株的發(fā)生方式及愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間的長短有直接關(guān)系。第23頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二倍性鑒定的方法有：1、染色體直接計(jì)數(shù)法通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進(jìn)行制片，直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。

2、間接鑒定（1）掃描細(xì)胞光度儀鑒定（流式細(xì)胞儀）主要測定葉片單個(gè)細(xì)胞中DNA的含量確定細(xì)胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。（3）植株形態(tài)學(xué)鑒定法葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結(jié)實(shí)。第24頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二（4）雜交鑒定法自交或測交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細(xì)胞。（5）分子標(biāo)記鑒定包括生化標(biāo)記（如同工酶標(biāo)記）和分子標(biāo)記（如RFLP、RAPD、AFLP等）第25頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二染色體加倍單倍體植株不能正常結(jié)實(shí)，只有經(jīng)過染色體加倍、育性才能恢復(fù)，而且在遺傳上是純合的，為了獲得更多的二倍體植株，除了有意識(shí)的利用上述自發(fā)的核內(nèi)有絲分裂產(chǎn)生二倍體外，還需要通過人工方法使單倍體植株染色體加倍，成為純合二倍體。第26頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二染色體加倍（一）莖段培養(yǎng)將單倍體植株的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會(huì)有一定頻率的核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細(xì)胞，分化出純合的二倍體植株。（二）化學(xué)試劑誘變有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。1、秋水仙素誘導(dǎo)（1）浸泡法無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（2）生長錐處理秋水仙素水溶液直接涂抹生長點(diǎn)（頂芽或腋芽）。（3）培養(yǎng)基處理將單倍體植株和任何一部分作為外植體，種植在附加一定濃度和秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體。2、除草劑誘導(dǎo)（毒性小，引起植株的變異幾率小）第27頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二第28頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二第29頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二水稻花藥栽培第30頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二水稻花藥栽培第31頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二7.2花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)：即小孢子培養(yǎng)，是將花粉粒從花藥中分離出來進(jìn)行培養(yǎng)技術(shù)，花粉培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)一樣都是獲得植物單倍體的有效方法。第32頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二一、材料的選擇和預(yù)處理和花藥培養(yǎng)類似，供體植株的基因型和栽培條件、花粉的發(fā)育時(shí)期和預(yù)處理等，對(duì)花粉培養(yǎng)能否成功有著重要的影響。影響因素：1.不同植物及同一植物不同基因型材料在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，花粉培養(yǎng)的誘導(dǎo)頻率差異很大。2.供體植物的生理狀態(tài)對(duì)花粉的胚胎發(fā)生也有很大的影響。一般從發(fā)育健壯的植株上取花粉進(jìn)行培養(yǎng)效果較好。3.花粉培養(yǎng)還受供體植株生長條件的影響，如溫度、光照等因素。選擇合適的花粉發(fā)育時(shí)期是提高植株花粉誘導(dǎo)頻率的重要因素。不同作物適宜的花粉發(fā)育時(shí)期不同。和花藥培養(yǎng)一樣，適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可以提高花粉培養(yǎng)的成功率。第33頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二二、花粉的分離所得花粉需滿足以下條件：1.花粉的成活率較高2.發(fā)育整齊3.要達(dá)到一定數(shù)量4.無菌、無雜質(zhì)分離的方法有：1.擠壓法2.散落法3.器械法（1）小型攪拌器（2）超速旋切機(jī)如果需要，可以把以上三種方法分離所得的花粉進(jìn)一步用密度梯度離心純化第34頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二二、花粉的培養(yǎng)方法1.培養(yǎng)基和花藥培養(yǎng)類似，花粉培養(yǎng)中多使用過濾除菌液體培養(yǎng)基，其中的銨態(tài)氮濃度一般比較低，通常加入一些有機(jī)氮源。一般情況下，對(duì)于花粉胚狀體發(fā)生所需的植物生長物質(zhì)，不同種類、濃度效果不同，不同供體材料的反應(yīng)也不一致。第35頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二二、花粉的培養(yǎng)方法2.培養(yǎng)方法第36頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二7.2花藥和花粉培養(yǎng)中的白化苗問題植株白化苗現(xiàn)象第37頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二一、白化苗產(chǎn)生的因素1.外因1）光照條件的影響2）

溫度條件的影響

3）其他環(huán)境因素的影響2.內(nèi)因1）葉綠素等光合色素合成酶基因的突變2）質(zhì)體分化和葉綠體發(fā)育相