藥物分析第十一章抗生素詳解演示文稿

藥物分析第十一章抗生素詳解演示文稿1現在是1頁\一共有41頁\編輯于星期二（優(yōu)選）藥物分析第十一章抗生素2現在是2頁\一共有41頁\編輯于星期二本法的優(yōu)點：靈敏、用量小，結果直觀適用范圍廣：純度好的、差的制品，已知或新發(fā)現的抗生素均適用，同一類型的抗生素不需分離，可一次測定其總效價。缺點：操作步驟多，測定時間長，誤差大等。3現在是3頁\一共有41頁\編輯于星期二理化方法——適用于提純的產品以及化學結構已確定的抗生素優(yōu)點：迅速、準確、有較高的專屬性。缺點：對含有具同樣官能團雜質的供試品不適用，或需采取適當方法加以校正。而且當該法是利用某一類型抗生素的共同結構部分的反應時，所測得的結果，往往只能代表藥物的總的含量，并不一定能代表抗生素的生物效價。4現在是4頁\一共有41頁\編輯于星期二第二節(jié)β-內酰胺類抗生素頭孢菌素族青霉素族一、化學結構與性質*****6-氨基青霉烷酸7-氨基頭孢菌烷酸5現在是5頁\一共有41頁\編輯于星期二酸性：青霉素和頭孢菌素分子中的游離羧基具有相當強的酸性，大多數青霉素的pKa在2.5～2.8之間，能與無機堿或某些有機堿形成鹽。旋光性：青霉素族分子中含有三個手性碳原子，頭孢菌素族含有兩個手性碳原子，故都具有旋光性。6現在是6頁\一共有41頁\編輯于星期二β-內酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性：β-內酰胺環(huán)是該類抗生素的結構活性中心，其性質活潑，是分子結構中最不穩(wěn)定部分，其穩(wěn)定性與含水量和純度有很大關系。在酸、堿、青霉素酶、羥胺及某些金屬離子（銅、鉛、汞和銀）或氧化劑等作用下，易發(fā)生水解和分子重排，導致β-內酰胺環(huán)的破壞而失去抗菌活性。7現在是7頁\一共有41頁\編輯于星期二二、鑒別試驗（一）呈色反應羥肟酸鐵反應青霉素及頭孢菌素在堿性中與羥胺作用，β-內酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸；在稀酸中與高鐵離子呈色。茚三酮反應（側鏈含-氨基酸結構）與重氮苯磺酸的偶合反應（側鏈含酚羥基）硫酸-甲醛試驗8現在是8頁\一共有41頁\編輯于星期二（二）各種鹽的反應鉀、鈉離子的火焰反應有機胺鹽的特殊反應（如普魯卡因青霉素的重氮化-偶合反應）（三）色譜法高效液相色譜法（HPLC）薄層色譜法（TLC）中國藥典收載的頭孢菌素族藥物和大多數青霉素族藥物采用HPLC法進行鑒別。9現在是9頁\一共有41頁\編輯于星期二（四）光譜法IR——各國藥典對收載的β-內酰胺類抗生素幾乎均采用了本法進行鑒別。該類抗生素共有的特征峰：

－內酰胺環(huán)羰基的伸縮振動（1750～1800）仲酰胺的氨基、羰基的伸縮振動（3300cm-1±，1525cm-1±，1680cm-1±）羧酸離子的伸縮振動（1600cm-1±、1410cm-1±）UV——利用最大吸收波長鑒定法或利用水解產物的最大吸收波長鑒定法。10現在是10頁\一共有41頁\編輯于星期二三、特殊雜質的檢查本類抗生素的特殊雜質主要有高分子聚合物，有關物質，異構體等，一般采用HPLC法控制其量，也有采用測定雜質的吸收度來控制雜質量的。11現在是11頁\一共有41頁\編輯于星期二聚合物——HPLC法聚合物的檢查采用分子排阻色譜法。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經修飾凝膠如葡聚糖凝膠（sephadex）和聚丙烯酰胺凝膠（sepharose）等為填充劑?，F以頭孢他啶中頭孢他啶聚合物的測定為例12現在是12頁\一共有41頁\編輯于星期二色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

用葡聚糖凝膠G-10（40～120m）為填充劑，玻璃柱內徑1.3～1.5cm，床體積50～60mL；流動相A為含3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值7.0），流動相B為0.01%十二烷基硫酸鈉溶液；流速為每分鐘1mL；檢測波長為254nm。以流動相A為流動相，用1mg/mL藍色葡聚糖2000溶液進樣200L進行測定，理論板數應不低于900，拖尾因子在0.75～1.5，對照品溶液以流動相B為流動相，重復進樣200L，峰面積值的相對標準差應小于5.0%。排阻分子量在1000左右13現在是13頁\一共有41頁\編輯于星期二對照品溶液的制備：取頭孢他啶對照品適量，精密稱定，加水制成含頭孢他啶100g/1mL的溶液，搖勻。測定法：取本品適量，精密稱定，加水制成含頭孢他啶20mg/1mL的溶液，立即進樣200L，以流動相A為流動相進行測定，記錄色譜圖；另取對照品溶液200L注入液相色譜儀，以流動相B為流動相，記錄色譜圖，按外標法計算，本品含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計不得過0.3%。14現在是14頁\一共有41頁\編輯于星期二自身對照外標法的原理：該法是利用特定條件下β-內酰胺類抗生素可以締合成與高分子雜質有相似色譜行為的締合物，即在Kav=0處表現為單一的色譜峰。以藥物自身為對照品，測定其在特定條件下締合時的峰響應指標；然后改變色譜條件，測定樣品，記錄樣品色譜圖中Kav=0處的高分子雜質峰的響應指標，按外標法計算，即得樣品中高分子雜質相當于藥品本身的相對含量。Kav=有效分配系數15現在是15頁\一共有41頁\編輯于星期二自身對照液樣品液流動相B——0.01%十二烷基硫酸鈉溶液流動相A——含3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液締合物高聚物A高聚物﹤A締合物16現在是16頁\一共有41頁\編輯于星期二有關物質和異構體

例1頭孢呋辛酯中有關物質和異構體的檢查：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：要求頭孢呋辛酯A，B異構體之間、頭孢呋辛酯A異構體與頭孢呋辛酯△3-異構體之間的分離度R﹥1.5。頭孢呋辛酯A，B異構體、△3-異構體及E異構體峰的相對保留時間分別約為1.0、0.9、1.2及1.7和2.1。

異構體——供試品色譜圖中A異構體峰的面積與A、B異構體峰的面積和之比應為0.48～0.55。有關物質——按自身對照法測定，E異構體不得過1.0%；△3-異構體不得過1.5%；其他單個雜質不得過0.5%并規(guī)定了總雜質量不得過3.0%。

17現在是17頁\一共有41頁\編輯于星期二1頭孢呋辛；2異構體B；3異構體A；4△3-異構體；5,6E異構體△3-異構體是取頭孢呋辛酯對照品經加熱破壞處理而制得，E異構體經紫外光照射24h制得。頭孢呋辛酯是由兩個非對映異構體頭孢呋辛酯A和B組成的混合物18現在是18頁\一共有41頁\編輯于星期二吸光度如青霉素鈉（鉀）的吸光度檢查：取本品，加水制成每1mL中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm的波長處測定吸收度，不得大于0.10；在264nm的波長處有最大吸收，吸收度應為0.80～0.88。此法中264nm處吸收值用來控制青霉素鈉（鉀）的含量，280nm處吸收值用來控制雜質的量。19現在是19頁\一共有41頁\編輯于星期二四、含量測定高效液相色譜法這是β-內酰胺類抗生素含量測定的主要方法。中國藥典收載的本類抗生素原料及制劑共約70種，應用HPLC法測定含量的有50多種，約占78%。本類藥物的HPLC法通常采用反相HPLC，以外標法計算含量。20現在是20頁\一共有41頁\編輯于星期二第三節(jié)氨基糖苷類抗生素這類抗生素的化學結構都是以堿性環(huán)已多元醇為苷元，與氨基縮合而成的苷，故稱為氨基糖苷類抗生素。主要有鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素及巴龍霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等它們的抗菌譜和化學性質都有共同之處。21現在是21頁\一共有41頁\編輯于星期二一、化學結構與性質鏈霉素鏈霉素22現在是22頁\一共有41頁\編輯于星期二慶大霉素R1R2R3分子式C1CH3CH3HC21H43N5O7C2CH3HHC20H41N5O7C2aHHCH3C20H41N5O7C1aHHHC19H29N5O7慶大霉素23現在是23頁\一共有41頁\編輯于星期二二、鑒別試驗茚三酮反應——本類抗生素具羥基胺類和α-氨基酸的性質，可與茚三酮縮合成藍紫色化合物。N-甲基葡萄糖胺反應——水解，產生葡萄糖胺衍生物，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，再與對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反應，生成櫻桃紅色縮合物。吡咯衍生物櫻桃紅色縮合物24現在是24頁\一共有41頁\編輯于星期二麥芽酚（Maltol）反應在堿性溶液中，鏈霉糖經分子重排、擴環(huán)、消除反應，生成麥芽酚，與鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。麥芽酚紫紅色為鏈霉素的專屬反應25現在是25頁\一共有41頁\編輯于星期二坂口（Sakaguchi）反應——鏈霉素水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍與8-羥基喹啉、次溴酸鈉反應，生成橙紅色化合物。為鏈霉素的專屬反應26現在是26頁\一共有41頁\編輯于星期二三、特殊雜質檢查及組分分析1、鏈霉素中鏈霉素B的檢查鏈霉素B是指甘露糖鏈霉素，由發(fā)酵產生,其生物活性僅為鏈霉素的20%~25%，能被甘露糖鏈霉素B苷酶水解成甘露糖和鏈霉素。中國藥典（2005）新規(guī)定了該項檢查，采用薄層色譜法測定。27現在是27頁\一共有41頁\編輯于星期二溶液配制供試品溶液：取本品0.25g，精密稱定，置回流瓶中，加入5ml新鮮配制的硫酸-甲醇溶液（397?）溶解，加熱回流1h，冷卻，用甲醇沖洗冷凝管，合并沖洗液，并用甲醇定量稀釋成每1ml中含10mg的溶液，作為供試品溶液。對照溶液：精密稱取甘露糖對照品約36mg，置回流瓶中，同法處理后定量制成每1ml中含72g的溶液，作為對照溶液。28現在是28頁\一共有41頁\編輯于星期二TLC方法薄層板：硅膠G點樣：各10μl，分別點于同一薄層板上展開劑：甲苯-醋酸-甲醇（5025?25?）顯色劑：新鮮配制的1，3-萘二酚與硫酸混合溶液，在110C加熱數分鐘顯色。限度：供試品溶液所顯鏈霉素B斑點的顏色與對照溶液的主斑點比較，不得更深（3.0%）。L=×100%×100%=3.0%70×4.1310×1000C×4.13S×1000根據1mg甘露糖相當于4.13mg的鏈霉素B，則:限量？29現在是29頁\一共有41頁\編輯于星期二2、硫酸奈替米星中有關物質的TLC檢查：供試品溶液：150mg/mL；標準品溶液（1）1.5mg/mL；標準品溶液（2）3mg/mL；標準品溶液（3）1.44mg西索米星/mL，點樣：各2L，展開劑：二氯甲烷-甲醇-濃氨溶液（4：4：2）顯色：0.2%茚三酮溶液，110℃加熱20min。30現在是30頁\一共有41頁\編輯于星期二結果：供試品溶液如顯雜質斑點，其顏色與標準品溶液（3）所顯主斑點相比較，不得更深（1%），其他雜質與標準品溶液（1）所顯主斑點相比較，均不得更深（1%），如有一點超過，應不深于標準品溶液（2）的主斑點（2%）。

注：奈替米星是由西索米星經化學衍生而成的半合成抗生素，因此在奈替米星成品中有可能殘留西索米星，需進行控制。樣西對1對2

供試品溶液：150mg/mL；標準液（1）1.5mg/mL；標準液（2）3mg/mL；標準液（3）1.44mg西索米星/mL31現在是31頁\一共有41頁\編輯于星期二3、慶大霉素C組分測定慶大霉素C1、C2、C1a對微生物的活性無明顯差異，但其毒副作用和耐藥性有差異，導致各組分的多少影響產品的效價和臨床療效。因此各國藥典均規(guī)定控制各組分的相對百分含量。慶大霉素無紫外吸收，當采用HPLC-紫外檢測器檢測時，需進行衍生化處理。由于其具有強極性和水溶性，為獲得理想的色譜結果，可采用離子對色譜法，以庚烷磺酸鈉為反離子。32現在是32頁\一共有41頁\編輯于星期二如USP（29）利用慶大霉素C組分結構中的氨基與鄰苯二醛（OPA）、巰基醋酸在pH10.4的硼酸鹽緩沖液中反應，生成1-烷基-2-烷基硫代異吲哚衍生物，在330nm波長處有強吸收。ChP和BP曾采用USP同樣的方法測定慶大霉素C組分，但在現版藥典中分別改用了蒸發(fā)光散射檢測器和電化學檢測器。慶大霉素OPA巰基醋酸異吲哚衍生物33現在是33頁\一共有41頁\編輯于星期二ChP（2005）采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測色譜條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（pH值范圍0.8～8.0）；0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（92：8）為流動相，流速0.6ml/min；蒸發(fā)光散射檢測器檢測34現在是34頁\一共有41頁\編輯于星期二系統(tǒng)適用性試驗分別稱取慶大霉素和小諾霉素標準品各適量，用流動相制成每1ml中各含0.2mg的溶液，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖.C組分的出峰順序從第二個主峰計，依次為慶大霉素C1a、C2、小諾霉素、C2a、C1；C2、小諾霉素和C2a峰之間的分離度應符合要求；連續(xù)進樣的小諾霉素峰面積的相對標準偏差應不大于2.0%。35現在是35頁\一共有41頁\編輯于星期二測定法取小諾霉素標準品適量，精密稱定，分別用流動相制成每1ml中約含小諾霉素0.2mg、0.5mg和1.0mg的溶液作為標準品溶液（1）、（2）、（3）。取上述三種溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算標準品溶液濃度的對數值與相應的主峰面積對數值的回歸方程，相關系數（r）應不小于0.99；lg0.2lg0.5lg1.0lgAr≥0.9936現在是36頁\一共有41頁\編輯于星期二另取本品適量，精密稱定，用流動相制成每1ml中約含慶大霉素2.5mg的溶液，同法測定，用回歸方程計算供試品中對應各組分的量（Xcx），并根據所得的各組分的量（Xcx）按下面公式計算出各組分的含量。式中Cx

為慶大霉素各組分的含量；C1應為25%～50%，C1a應為