臨床酶學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)詳解演示文稿

臨床酶學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有118頁\編輯于星期三（優(yōu)選）臨床酶學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)現(xiàn)在是2頁\一共有118頁\編輯于星期三教學(xué)目標(biāo)與要求——熟悉1.酶動力學(xué)參數(shù)的含義2.電泳法和免疫抑制法測定同工酶的原理3.AMY、CHE的測定原理3現(xiàn)在是3頁\一共有118頁\編輯于星期三教學(xué)目標(biāo)與要求——了解

1.酶蛋白質(zhì)量測定的優(yōu)點(diǎn)2.定時法測定臨床常用診斷酶的原理和評價3.同工酶的其他檢測方法4現(xiàn)在是4頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的概念：人衛(wèi)第六版

酶（enzyme）是由活細(xì)胞合成的、對其特異底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)，是機(jī)體內(nèi)催化各種代謝反應(yīng)最主要的生物催化劑(biocatalyst)。人衛(wèi)第七版

生物體內(nèi)的酶（enzyme）是對其特異底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)和核糖核酸，前者是是機(jī)體內(nèi)催化各種代謝反應(yīng)最主要的催化劑。概述5現(xiàn)在是5頁\一共有118頁\編輯于星期三酶促反應(yīng)表示為：

底物：Subestrate：S產(chǎn)物：Product：P酶：Enzyme：E概述6現(xiàn)在是6頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的化學(xué)本質(zhì)：

絕大多數(shù)的酶是蛋白質(zhì)，稱這類酶為enzyme具有催化功能的RNA被稱為核酶(ribozyme)具有催化功能的DNA被稱為脫氧核酶(deoxyribozyme)概述7現(xiàn)在是7頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的研究歷史：1926年首次從刀豆制備出脲酶結(jié)晶，證明其為蛋白質(zhì)，并提出酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)的觀點(diǎn)

1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第1個有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑1995年，JackW.Szostak研究室首先報道了具有DNA連接酶活性的DNA片段，稱之為脫氧核酶(deoxyribozyme)概述8現(xiàn)在是8頁\一共有118頁\編輯于星期三臨床酶學(xué)

高診斷靈敏度高診斷特異性

臨床酶學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

酶活性測定酶蛋白質(zhì)量測定概述9現(xiàn)在是9頁\一共有118頁\編輯于星期三臨床酶學(xué)的歷史：

1908年Wohlgemuth用尿淀粉酶（AMY）診斷急性胰腺炎1930s，LPS、ALP、ACP開始用于臨床——定時法1950s，Karmen、LaDue、Wroblewski等人建立了分光光度法，ALT、AST、CK、LD等酶活性測定應(yīng)用于肝膽疾病、心臟疾病的診斷——連續(xù)監(jiān)測法1970s，同工酶和酶蛋白質(zhì)量測定1980s，同工酶亞型概述10現(xiàn)在是10頁\一共有118頁\編輯于星期三目錄酶學(xué)基本知識1血清酶變化的生理病理機(jī)制2酶含量的表示方法3酶催化活性濃度測定的理論基礎(chǔ)4酶活性測定的影響因素與最適條件的確定5同工酶檢測技術(shù)6目前常用診斷酶的酶活性測定7小結(jié)與展望8返回總目錄11現(xiàn)在是11頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的結(jié)構(gòu)和分類一酶的特性和應(yīng)用二酶促反應(yīng)動力學(xué)三第一節(jié)酶學(xué)基本知識12現(xiàn)在是12頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的結(jié)構(gòu)和分類一輔因子（一）酶的組成單純酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等結(jié)合酶酶蛋白（apoenzyme）（cofacter)輔酶（coenzyme)輔基(prostheticgroup)全酶(holoenzyme）=酶蛋白+輔因子全酶13現(xiàn)在是13頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的結(jié)構(gòu)和分類一（二）酶的分子形式單體酶：只有單一的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)成寡聚酶：由兩個以上具有三級結(jié)構(gòu)的亞基聚合而成多酶復(fù)合體：由幾個功能相關(guān)的酶嵌合而成的復(fù)合體(oligomericenzyme)(multienzymesystem)（monomericenzyme)14現(xiàn)在是14頁\一共有118頁\編輯于星期三乳酸脫氫酶同工酶115現(xiàn)在是15頁\一共有118頁\編輯于星期三（三）酶的結(jié)構(gòu)“非”必需基團(tuán)必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)：催化基團(tuán)：活性中心：酶分子中直接和底物結(jié)合并起催化反應(yīng)的空間局限（部位）酶的結(jié)構(gòu)和分類一(Bindingsite)(Catalyticsite)決定酶的專一性決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)（活性中心）16現(xiàn)在是16頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的結(jié)構(gòu)和分類——結(jié)合基團(tuán)一17現(xiàn)在是17頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的結(jié)構(gòu)和分類——活性中心一牛胰蛋白酶

18現(xiàn)在是18頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的特性和應(yīng)用二酶的特性（一）化學(xué)本質(zhì)：除核酶、脫氧核酶以外，為蛋白質(zhì)（二）高效催化性（三）高度特異性（四）可調(diào)節(jié)性（五）不穩(wěn)定性19現(xiàn)在是19頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的特性——高效催化性二20現(xiàn)在是20頁\一共有118頁\編輯于星期三反應(yīng)總能量改變非催化反應(yīng)活化能

酶促反應(yīng)活化能

一般催化劑催化反應(yīng)的活化能

能量

反應(yīng)過程底物產(chǎn)物

酶促反應(yīng)活化能的改變

酶的特性——高效催化性的機(jī)理二21現(xiàn)在是21頁\一共有118頁\編輯于星期三22現(xiàn)在是22頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的特性——高效催化性的機(jī)理二collision

：碰撞

23現(xiàn)在是23頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的特性——高效催化性的機(jī)理二24現(xiàn)在是24頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的特性——高效催化性的機(jī)理二25現(xiàn)在是25頁\一共有118頁\編輯于星期三一種酶僅作用于一種或一類化合物，或一定的化學(xué)鍵，催化一定的化學(xué)反應(yīng)并生成一定的產(chǎn)物。酶的這種特性稱為酶的特異性或?qū)Ｒ恍浴?/p>

酶的特性——高度特異性(specificity)二26現(xiàn)在是26頁\一共有118頁\編輯于星期三絕對特異性(absolutespecificity)：只能作用于特定結(jié)構(gòu)的底物，進(jìn)行一種專一的反應(yīng)，生成一種特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物

。相對特異性(relativespecificity)：作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵。立體結(jié)構(gòu)特異性(stereo

specificity)：作用于立體異構(gòu)體中的一種。酶的特性——高度特異性(specificity)二27現(xiàn)在是27頁\一共有118頁\編輯于星期三酶的特性——高度特異性(specificity)二μmol/L

28現(xiàn)在是28頁\一共有118頁\編輯于星期三對酶生成與降解量的調(diào)節(jié)酶催化效率的調(diào)節(jié)通過改變底物濃度的調(diào)節(jié)廣義上講:多酶體系、關(guān)鍵酶（限速酶）酶的特性——可調(diào)節(jié)性二29現(xiàn)在是29頁\一共有118頁\編輯于星期三酶促反應(yīng)在溫和條件下進(jìn)行加熱、過酸、過堿、重金屬都可以使酶活性降低（失活）酶的特性——不穩(wěn)定性二30現(xiàn)在是30頁\一共有118頁\編輯于星期三●

改變

pH●

急速

加熱

●

加入變性劑●

加入金屬鰲合劑●

加入酶抑制劑抑制劑●

大量稀釋TCABoilingSDSEDTAPMSF-----化學(xué)物理化學(xué)化學(xué)化學(xué)物理酶不穩(wěn)定性——終止酶促反應(yīng)的方法補(bǔ)充PMSF：Phenylmethanesulfonylfluoride，苯甲基磺酰氟，用于抑制蛋白酶

31現(xiàn)在是31頁\一共有118頁\編輯于星期三

添加物

作用

一般使用濃度Tween-20,TritonX-100NaN3(sodiumazide)EDTAb-MercaptoethanolDithiothreitol(DTTorDTE)BSA(bovineserumalbumin)Glycerol,glucosePMSF,TPCK,TLCK,benzamidine

除去重金屬

抑菌劑防凍劑蛋白酶抑制劑

表面活性劑

抗氧化劑

抗氧化劑

穩(wěn)定劑

0.1～1mmol/L0.01%50%微量0.5～0.05%1～

10mmol/L1～

5mmol/L0.1～

10mg/mL酶不穩(wěn)定性——緩沖液常用的添加物補(bǔ)充32現(xiàn)在是32頁\一共有118頁\編輯于星期三添加物TLCK：對甲苯磺酰-L-賴氨酸氯甲基酮TPCK：L-苯甲磺酰苯丙氨酰氯甲酮Benzamidine芐瞇β-Mercaptoethanol：β-巰基乙醇Dithiothreitol(DTT)：二硫蘇糖醇

補(bǔ)充33現(xiàn)在是33頁\一共有118頁\編輯于星期三表4-1酶在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用舉例主要特性應(yīng)用技術(shù)舉例化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)高效催化性、高度特異性、反應(yīng)條件溫和催化劑反應(yīng)前后沒有變化形成中間絡(luò)合物酶催化活性與酶量成正比高效催化性酶蛋白定量酶法測定代謝物固相酶技術(shù)抗體酶診斷酶學(xué)ELISACK-MB質(zhì)量、前列腺特異抗原己糖激酶法測定血糖葡萄糖氧化酶膜電極測血糖抗病毒疫苗ALT、CKPOD、ALP

酶的特性和應(yīng)用二34現(xiàn)在是34頁\一共有118頁\編輯于星期三臨床應(yīng)用酶EC編號習(xí)慣用名英語縮寫EC編號習(xí)慣用名英語縮寫1.1.1.27乳酸脫氫酶LD、LDH2.7.3.2肌酸激酶CK、CPK1.1.1.37蘋果酸脫氫酶MD、MDH3.1.1.3脂肪酶LPS1.1.1.41異檸檬酸脫氫酶ICD、ICDH3.1.1.8膽堿酯酶CHE1.1.1.496-磷酸葡萄糖脫氫酶G6PDH3.1.3.1堿性磷酸酶ALP、AKP1.4.1.3谷氨酸脫氫酶GLD、GLDH3.1.3.2酸性磷酸酶ACP1.4.3.4單氨氧化酶MOD3.1.3.55'-核苷酸酶5'-NT2.1.3.3鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶OCT3.2.1.1α-淀粉酶AMY、AMS2.3.2.2γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶γ-GT、GGT3.2.1.30β-N-乙酰(基)-D氨基葡萄糖苷酶NAG2.4.1.1糖原磷酸化酶GP3.2.1.51α-L-巖藻糖苷酶α-FU、AFU2.5.1.18谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST3.4.23.1亮氨酸氨基肽酶LAP2.6.1.1門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST、GOT4.1.2.13果糖二磷酸醛縮酶ALD2.6.1.2丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、GPT酶的命名、分類及編號補(bǔ)充35現(xiàn)在是35頁\一共有118頁\編輯于星期三酶促反應(yīng)動力學(xué)（KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction

）三（一）米氏方程（二）酶促反應(yīng)進(jìn)程（三）動力學(xué)參數(shù)（四）酶偶聯(lián)反應(yīng)36現(xiàn)在是36頁\一共有118頁\編輯于星期三（一）米氏方程1913年，德國化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說對酶促反映的動力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。酶促反應(yīng)動力學(xué)三37現(xiàn)在是37頁\一共有118頁\編輯于星期三38現(xiàn)在是38頁\一共有118頁\編輯于星期三（二）酶促反應(yīng)進(jìn)程1.延滯期是指酶促反應(yīng)開始至達(dá)到最大反應(yīng)速度所需要的時間2.線性期是指酶促反應(yīng)速度保持恒定的時期，不受底物濃度的影響3.非線性期隨著反應(yīng)時間的延長，底物消耗越來越明顯，酶促反應(yīng)速度明顯下降，偏離線性而進(jìn)入非線性期酶促反應(yīng)進(jìn)程好似100m徑賽酶促反應(yīng)動力學(xué)三39現(xiàn)在是39頁\一共有118頁\編輯于星期三圖4-1酶促反應(yīng)時間進(jìn)程曲線酶促反應(yīng)動力學(xué)三濃度(C)40現(xiàn)在是40頁\一共有118頁\編輯于星期三（三）動力學(xué)參數(shù)1.初速度(initialvelocity)指在反應(yīng)最初階段底物的消耗量很?。ㄒ话阍?﹪以內(nèi)）時的反應(yīng)速度，用v0來表示2.最大反應(yīng)速度(maximumvelocity)指當(dāng)酶的結(jié)合位點(diǎn)與底物結(jié)合飽和時的反應(yīng)速度，通常用V或Vmax來表示3.米氏常數(shù)（Michaelisconstant，Km）指酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位同底物濃度酶促反應(yīng)動力學(xué)三41現(xiàn)在是41頁\一共有118頁\編輯于星期三（四）酶偶聯(lián)反應(yīng)

Ex：待測酶

Ea：輔助酶Ei：指示酶

酶促反應(yīng)動力學(xué)三42現(xiàn)在是42頁\一共有118頁\編輯于星期三酶促反應(yīng)動力學(xué)三圖4-2IFCC推薦法測定ALT的時間進(jìn)程曲線圖4-2IFCC推薦法測定ALT的時間進(jìn)程曲線43現(xiàn)在是43頁\一共有118頁\編輯于星期三酶偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)程1.預(yù)孵育期2.延滯期3.線性期4.非線性期酶促反應(yīng)動力學(xué)三返回章目錄44現(xiàn)在是44頁\一共有118頁\編輯于星期三血清酶的來源與去路一血清酶變化的生理機(jī)制二血清酶變化的病理機(jī)制三第二節(jié)血清酶變化的生理病理機(jī)制45現(xiàn)在是45頁\一共有118頁\編輯于星期三（一）按血清酶的來源分

1.血漿固有酶2.非血漿固有酶

①外分泌酶②細(xì)胞酶

注：除凝血酶和纖溶酶外，血清酶與血漿酶基本一致

（二）按診斷特異性分①非器官特異酶②器官特異酶血清酶的來源與去路一46現(xiàn)在是46頁\一共有118頁\編輯于星期三（三）血清酶的去路

1.腎小球?yàn)V過從尿液中排出

2.網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除

3.血管內(nèi)失活或滅活血清酶的來源與去路一47現(xiàn)在是47頁\一共有118頁\編輯于星期三1.性別2.年齡3.飲食4.運(yùn)動5.妊娠血清酶變化的生理變異二48現(xiàn)在是48頁\一共有118頁\編輯于星期三1.酶合成異常2.細(xì)胞內(nèi)酶的滲漏3.酶進(jìn)入血液的方式4.其他血清酶變化的病理機(jī)制三返回章目錄49現(xiàn)在是49頁\一共有118頁\編輯于星期三酶活性濃度表示法一酶蛋白質(zhì)量濃度表示法二第三節(jié)酶含量的表示方法50現(xiàn)在是50頁\一共有118頁\編輯于星期三（一）酶活性單位

1.慣用單位2.國際單位：在特定條件下，1分鐘能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物（μmol/min）的酶量為一個“國際單位”3.Katal單位：即每秒鐘轉(zhuǎn)化1個摩爾底物（mol/s）的酶量酶活性濃度表示法一

51現(xiàn)在是51頁\一共有118頁\編輯于星期三（二）酶活性濃度指單位體積樣品中的酶活性單位，習(xí)慣用U/L來表示體液中酶活性即酶活性濃度（三）正常上限升高倍數(shù)（upperlimitsofnormal,ULN)：是指用測得的酶活性結(jié)果除以參考范圍上限

酶活性濃度表示法一

52現(xiàn)在是52頁\一共有118頁\編輯于星期三以mg/Ｌ或μg/Ｌ來表示優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高②特異性高③可測定無活性的酶④與酶活性測定一起，計算免疫比活性，可能提供新的資料和信息⑤在同工酶測定中更有價值酶蛋白質(zhì)量濃度表示法二

返回章目錄53現(xiàn)在是53頁\一共有118頁\編輯于星期三定時法（Fixedtimeassay）

一連續(xù)監(jiān)測法（Continuousmonitoringassay）二第四節(jié)酶催化活性濃度測定的理論基礎(chǔ)54現(xiàn)在是54頁\一共有118頁\編輯于星期三酶含量測定酶蛋白質(zhì)量酶活性測定｛定時法連續(xù)監(jiān)測法55現(xiàn)在是55頁\一共有118頁\編輯于星期三（一）概念

將酶與底物在特定條件（緩沖液、溫度等）下孵育，經(jīng)過一定時間后，用終止液終止反應(yīng)，通過化學(xué)或生物化學(xué)的方法測出底物或產(chǎn)物的總變化量，除以時間即可計算出底物消耗速度（－d[S]/min）或產(chǎn)物生成速度（d[P]/min），將速度換算為μmol/min便是以國際單位表示的酶活性。定時法一

56現(xiàn)在是56頁\一共有118頁\編輯于星期三（二）計算

定時法一

57現(xiàn)在是57頁\一共有118頁\編輯于星期三定時法無機(jī)P酚氨萘胺NAD(P)HH2O2酮酸淀粉ALT、AST、LDALP、ACP、5’NTALP、ACPADA、脲酶CK、GGTLD、GLD、G6PDALTAMS（三）定時法的方法設(shè)計顯色物項(xiàng)目58現(xiàn)在是58頁\一共有118頁\編輯于星期三（一）概念

將酶與底物在特定條件（緩沖液、溫度等）下孵育，每隔一定時間（2s～60s）連續(xù)測定酶促反應(yīng)過程中某一底物或產(chǎn)物的特征信號的變化，從而計算出每分鐘的信號變化速率。

連續(xù)監(jiān)測法二

59現(xiàn)在是59頁\一共有118頁\編輯于星期三60現(xiàn)在是60頁\一共有118頁\編輯于星期三連續(xù)監(jiān)測法二61現(xiàn)在是61頁\一共有118頁\編輯于星期三連續(xù)監(jiān)測法二62現(xiàn)在是62頁\一共有118頁\編輯于星期三連續(xù)監(jiān)測法二（二）計算63現(xiàn)在是63頁\一共有118頁\編輯于星期三連續(xù)監(jiān)測法二64現(xiàn)在是64頁\一共有118頁\編輯于星期三連續(xù)監(jiān)測法色素原底物NAD(P)H系統(tǒng)過氧化物酶系統(tǒng)其他ALP、ALP、GGT、GPDA、AMS、AFULD、G6PD、HBDH、AD、SD、GLD、ALT、AST、CK、ADALPS、ADA、5’-NTCHE、ACP（三）連續(xù)監(jiān)測法的方法設(shè)計65現(xiàn)在是65頁\一共有118頁\編輯于星期三定時法連續(xù)監(jiān)測法測總變化量，平均速度測速率終止酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)一直進(jìn)行多用化學(xué)方法檢測多用酶偶聯(lián)反應(yīng)定時法與連續(xù)監(jiān)測法的區(qū)別含延滯期或非線性期只計算線性期速度返回章目錄66現(xiàn)在是66頁\一共有118頁\編輯于星期三方法因素的影響

一測定條件的影響與最適條件的確定二第五節(jié)酶活性測定的影響因素與最適條件的確定其他因素對測定結(jié)果影響三67現(xiàn)在是67頁\一共有118頁\編輯于星期三電位滴定法濁度法時間滴定法比色法分光光度法生物傳感器熒光按監(jiān)測手段各類終點(diǎn)法LPSNAD(P)HAMSCHENAD(P)HALT方法因素的影響

一68現(xiàn)在是68頁\一共有118頁\編輯于星期三方法因素的影響

一終點(diǎn)法測產(chǎn)物測底物連續(xù)監(jiān)測法按監(jiān)測對象按監(jiān)測速度方式｛｛69現(xiàn)在是69頁\一共有118頁\編輯于星期三方法因素的影響

一樣品啟動逆向正向底物啟動按反應(yīng)方向按啟動類型｛｛70現(xiàn)在是70頁\一共有118頁\編輯于星期三

根據(jù)產(chǎn)物生成量或底物消耗量(C)與酶活性(v)、酶量（[E])、反應(yīng)時間(t)成正比例的關(guān)系。如淀粉酶（碘淀粉顯色原理）測定又可分為：

樣品稀釋法---------改變[E]

時間滴定法---------改變t

碘淀粉比色法-----改變v方法因素的影響

一71現(xiàn)在是71頁\一共有118頁\編輯于星期三

1、產(chǎn)物生成類：根據(jù)產(chǎn)物生成量與酶活性、酶量、反應(yīng)時間成正比例的關(guān)系，從無到有，從少到多進(jìn)行測定，檢測敏感度高。

2、底物消耗類：測定底物，從多到少，而底物消耗不明顯，測定誤差大，檢測范圍窄。如碘淀粉比色法。

方法因素的影響

一72現(xiàn)在是72頁\一共有118頁\編輯于星期三

指反應(yīng)所需的試劑先混合在一起，然后加入樣品，依靠樣品中的待測酶來啟動酶促反應(yīng)，只在延滯期去除部分干擾物，抗干擾能力等同單一試劑劑型，需要注意的是某些雙試劑劑型是基于試劑穩(wěn)定性考慮，并沒有單獨(dú)將底物作為第二試劑，也起不到消除內(nèi)源性干擾的作用。

樣品啟動模式

方法因素的影響

一73現(xiàn)在是73頁\一共有118頁\編輯于星期三指樣品先與部分試劑（缺乏某個底物）預(yù)孵育一定時間，部分消除某些內(nèi)源性、外源性干擾物以及雜酶的副反應(yīng)，然后加入這個底物，啟動待測酶酶促反應(yīng)。需要雙試劑劑型，IFCC推薦法多采用底物啟動模式。底物啟動模式

方法因素的影響

一74現(xiàn)在是74頁\一共有118頁\編輯于星期三測定條件的影響與最適條件的確定二最適條件（optimumcondition）的概念：是指能滿足酶發(fā)揮最大催化效率所需的條件。75現(xiàn)在是75頁\一共有118頁\編輯于星期三1.合適的底物和最適底物濃度2.理想的緩沖液種類和最適離子強(qiáng)度；反應(yīng)液的最適pH3.最適反應(yīng)溫度4.合適的輔因子、激活劑濃度；酶偶聯(lián)反應(yīng)還需要確定指示酶和輔助酶的用量5.合理的測定時間，延滯期應(yīng)盡量短暫并有足夠的線性期6.合適的樣品與反應(yīng)試劑的比例；足夠的檢測范圍7.盡量去除各種抑制劑測定條件的影響與最適條件的確定二76現(xiàn)在是76頁\一共有118頁\編輯于星期三底物選擇的原則是：①選擇Km最小的底物②要有足夠的溶解度③酶對底物特異性高④底物穩(wěn)定性好⑤較高臨床價值的底物

測定條件的影響與最適條件的確定二1.底物的確定77現(xiàn)在是77頁\一共有118頁\編輯于星期三底物濃度的確定：①單底物酶促反應(yīng)：選擇[S]＝10Km～20Km，此時反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度90.9%～95.2%

②雙底物酶促反應(yīng)：[A]/[B]之間的關(guān)系是一條雙曲線，有無數(shù)組數(shù)據(jù)。采取最經(jīng)濟(jì)原則。F（一般選90%或95%）

測定條件的影響與最適條件的確定二1.底物的確定78現(xiàn)在是78頁\一共有118頁\編輯于星期三緩沖液種類的選擇原則：①盡量使用活性緩沖液②pKa與測定pH比較接近，有足夠的緩沖容量

③純度高，不含有抑制酶活性的雜質(zhì)

④溫度依數(shù)性小

⑤對酶有穩(wěn)定作用

測定條件的影響與最適條件的確定二2.緩沖液的確定79現(xiàn)在是79頁\一共有118頁\編輯于星期三緩沖液離子強(qiáng)度的確定：離子強(qiáng)度越高，電解質(zhì)干擾酶和底物結(jié)合，酶活性將逐步下降，能滿足緩沖容量的要求即可。①大多數(shù)酶活性測定的離子強(qiáng)度在0.1mmol/L左右②ALP用AMP緩沖液，離子強(qiáng)度達(dá)到0.9mmol/L，有磷酸基團(tuán)接受體作用③GGT用高濃度的雙甘肽有?；邮荏w作用測定條件的影響與最適條件的確定二2.緩沖液的確定80現(xiàn)在是80頁\一共有118頁\編輯于星期三測定條件的影響與最適條件的確定二81現(xiàn)在是81頁\一共有118頁\編輯于星期三常用的緩沖液：N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES）N，N’-雙（2-乙磺酸）哌嗪（PIPES）三羥甲基氨基甲烷（Tris）二乙醇胺（DEA）三乙醇胺（TRA）2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP）

測定條件的影響與最適條件的確定二2.緩沖液的確定82現(xiàn)在是82頁\一共有118頁\編輯于星期三在1986年以前IFCC推薦酶活性測定的溫度是30℃2002年IFCC正式發(fā)表了“37℃下檢測酶催化活性濃度的IFCC一級參考方法操作手冊和參考制品認(rèn)可系統(tǒng)”目前基本無異議，確定37℃為酶活性測定溫度測定條件的影響與最適條件的確定二3.反應(yīng)溫度的確定83現(xiàn)在是83頁\一共有118頁\編輯于星期三①脫輔基酶的酶活性恢復(fù)——預(yù)孵育期②EDTA——絡(luò)合重金屬離子③巰基酶需巰基試劑做激活劑反復(fù)實(shí)驗(yàn)法確定用量測定條件的影響與最適條件的確定二4.輔助因子、輔助酶的確定84現(xiàn)在是84頁\一共有118頁\編輯于星期三①延滯期的確定原則是多觀察幾例濃度不等、病理情況不同的標(biāo)本，選擇延滯期最長者作為確定值。②線性期的確定線性期的確定與酶濃度的可測上限與非線性度有關(guān)。③計算非線性度，按最小二乘法的計算要求，讀數(shù)次數(shù)應(yīng)不少于4次，讀數(shù)間隔按一般儀器要求30s就足夠了，線性期在2min以上即可。測定條件的影響與最適條件的確定二5.反應(yīng)時間的確定85現(xiàn)在是85頁\一共有118頁\編輯于星期三樣品量與反應(yīng)液總量的比例與方法檢測的靈敏度和檢測上限有關(guān)，與測定誤差也有關(guān)①樣品/試劑越大可測上限越小，靈敏度越高，K值越小。1：10～1：100之間，1：30左右比較合適（CHE為特例，1：601）②改變樣品/試劑是改變K值最簡單的方法，K值一般確定在2000～5000之間③可測上限的確定與臨床樣品的分布和臨床意義有關(guān)，有些儀器具有線性擴(kuò)展功能測定條件的影響與最適條件的確定二6.樣品/試劑、可測上限的確定86現(xiàn)在是86頁\一共有118頁\編輯于星期三①最常見的抑制劑有產(chǎn)物的抑制、底物的抑制，分析器材或試劑中的重金屬及體液中的藥物等造成的抑制。②采取的措施：選用高純度的原料、高純凈水、器材干凈，在反應(yīng)液中加入金屬螯合劑，甚至可以引入一個副反應(yīng)來去除產(chǎn)物的抑制作用等。測定條件的影響與最適條件的確定二7.抑制劑的去除87現(xiàn)在是87頁\一共有118頁\編輯于星期三（一）儀器待測物的摩爾吸光系數(shù)與儀器波長的準(zhǔn)確性、帶寬、比色杯透光性有關(guān)。K值的設(shè)置還需考慮稀釋體積、比色杯的光徑、副波長等因素影響（二）校準(zhǔn)物（三）實(shí)驗(yàn)參數(shù)（四）副反應(yīng)的干擾其他因素的影響三88現(xiàn)在是88頁\一共有118頁\編輯于星期三實(shí)測K值理論K值校準(zhǔn)K值其他因素的影響三K值的校正89現(xiàn)在是89頁\一共有118頁\編輯于星期三SPEt酶量合適的測定方法激活劑反應(yīng)時間10～20Km緩沖液溫度vo=Pt去除抑制劑底物返回章目錄90現(xiàn)在是90頁\一共有118頁\編輯于星期三電泳法一抑制法

二第六節(jié)同工酶檢測技術(shù)其他方法三91現(xiàn)在是91頁\一共有118頁\編輯于星期三同一種屬中由不同基因或等位基因編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化作用，但其分子構(gòu)成、空間構(gòu)像、理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及器官分布或細(xì)胞內(nèi)定位不同的一組酶稱為同工酶（isoezyme）凡酶蛋白結(jié)構(gòu)不同的同工酶稱為原級同工酶，而將經(jīng)加工或修飾后的同工酶稱為次級同工酶或酶多種形式

某些同工酶從組織進(jìn)入體液后在蛋白酶作用下降解成不同的亞型（isoform）

同工酶及亞型的概念92現(xiàn)在是92頁\一共有118頁\編輯于星期三原理：由于各型同工酶的一級結(jié)構(gòu)或空間構(gòu)象不同，形狀也不同，因而帶電性質(zhì)不同，在電場中的電泳遷移率不同，使各型同工酶分離,然后用酶催化性質(zhì)選擇合適的顯色系統(tǒng)使區(qū)帶呈色評價：優(yōu)點(diǎn)是選擇合適的電泳條件可獲得同工酶譜的全貌但缺點(diǎn)是其顯色系統(tǒng)不可能是所有同工酶的最適條件，而且定量也比較困難只是一種半定量的方法酶與體內(nèi)的白蛋白、免疫球蛋白等復(fù)合物形成“矯作物”電泳法一93現(xiàn)在是93頁\一共有118頁\編輯于星期三常用的顯色系統(tǒng)有：①重氮試劑染料：ALP、GGT同工酶的測定②電子傳遞染料：脫氫酶反應(yīng)或脫氫酶偶聯(lián)的指示反應(yīng)產(chǎn)生NAD（P）H，其中H+

經(jīng)酚嗪甲酯硫酸鹽（PMS）傳遞，交給四氮唑鹽生成不溶性有色的甲臜（formazan，音z?。┗衔?。LDH同工酶的測定

電泳法一94現(xiàn)在是94頁\一共有118頁\編輯于星期三蛋白質(zhì)同工酶支持物準(zhǔn)備、平衡、加樣、電泳固定后染色蛋白質(zhì)染料不固定酶促反應(yīng)產(chǎn)物顯色掃描定量掃描定量電泳法測定同工酶與蛋白質(zhì)區(qū)別支持物準(zhǔn)備、平衡、加樣、電泳95現(xiàn)在是95頁\一共有118頁\編輯于星期三原理：免疫抑制法原理是利用某一亞基的特異性抗體與同工酶中對應(yīng)的亞基特異結(jié)合而抑制其活性；化學(xué)抑制法是利用一定濃度某些化學(xué)試劑選擇性抑制某類同工酶；分別測定抑制前后的酶活性，間接計算出各類同工酶的活性。評價：免疫抑制法優(yōu)點(diǎn)是抑制特異性高；缺點(diǎn)是需要制備抗體，測定成本高?；瘜W(xué)抑制法往往存在待測同工酶同時被抑制或其他同工酶抑制不徹底的缺點(diǎn)。抑制法二96現(xiàn)在是96頁\一共有118頁\編輯于星期三原理：利用各型同工酶對熱的穩(wěn)定性差異的原理來測定同工酶。如堿性磷酸酶同工酶分為四型：腸型、生殖細(xì)胞型、胎盤型和非特異組織型。非特異組織型是在酶蛋白合成后，經(jīng)過不同形式的修飾和加工，形成的肝型、膽型、腎型、骨骼型等酶的多種形式。各型對熱穩(wěn)定性：胎盤型>小腸型>其他型。若經(jīng)65℃15min的樣品預(yù)處理后只留下胎盤型同工酶。評價：因特異性較差而較少使用。其他方法三熱變性97現(xiàn)在是97頁\一共有118頁\編輯于星期三原理：利用糖鏈親和劑凝集素如麥胚凝集素（WGA）、刀豆凝集素（ConA）等與同工酶結(jié)合率的不同，對某型同工酶加以分離后進(jìn)行測定。

ALP骨型同工酶與WGA有較高的親和力，結(jié)合后形成沉淀，總酶活性減去上清液中未結(jié)合部分的酶活性就是骨型同工酶的活性。評價：因特異性較差而較少使用。其他方法三親和層析法

返回章目錄98現(xiàn)在是98頁\一共有118頁\編輯于星期三ALT/AST一CK二第七節(jié)目前常用診斷酶的酶活性測定ALP三GGT

四LD五AMS六CHE七99現(xiàn)在是99頁\一共有118頁\編輯于星期三1.測定谷氨酸以酶電極法作代表，因需特殊儀器不適合臨床檢驗(yàn)2.測定丙酮酸①以賴氏法為代表的定時法②以IFCC推薦法為代表的連續(xù)監(jiān)測法③偶聯(lián)丙酮酸氧化酶法丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測定一（一）方法選擇與評價100現(xiàn)在是100頁\一共有118頁\編輯于星期三丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測定一（二）ALT推薦方法101現(xiàn)在是101頁\一共有118頁\編輯于星期三丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測定一（二）AST推薦方法102現(xiàn)在是102頁\一共有118頁\編輯于星期三1.

α-酮戊二酸的用量2.內(nèi)源性丙酮酸和GLDH的干擾3.添加5’-磷酸砒哆醛4.兩個指示酶5.預(yù)孵育期長丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測定一（二）推薦方法103現(xiàn)在是103頁\一共有118頁\編輯于星期三比色法連續(xù)監(jiān)測法熒光法化學(xué)發(fā)光法肌酸激酶測定二（一）方法選擇與評價104現(xiàn)在是104頁\一共有118頁\編輯于星期三肌酸激酶的測定二（二）推薦方法105現(xiàn)在是105頁\一共有118頁\編輯于星期三肌酸激酶測定二（二）推薦方法1.緩沖液和pH2.巰基激活物3.腺苷酸激酶的干擾和消除4.EDTA的作用5.樣品保存106現(xiàn)在是106頁\一共有118頁\編輯于星期三1.以布氏（Bodansky）法為代表：β-甘油磷酸鈉做底物2.以金-阿（King-Armstrong）法為代表：磷酸苯二鈉做底物3.以皮-勞（Bessey-Lowery-Brock）法為代表：人工合成底物：磷酸對硝基酚二鈉鹽（PNPP）堿性磷酸酶的測定

三（一）方法選擇與評價107現(xiàn)在是107頁\一共有118頁\編輯于星期三1.

AMP緩沖液2.底物有一定自身水解作用

堿性磷酸酶的測定

三（二）推薦方法108現(xiàn)在是108頁\一共有118頁\編輯于星期三1.L-γ-谷氨酰-α（β）-萘胺做底物，催化生成的α（β）-萘胺與重氮試劑生成紅色化合物。2.γ-L-谷氨酰對硝基苯胺（GNA）做底物，催化生成的對硝基苯胺在堿性環(huán)境下呈黃色，可以連續(xù)監(jiān)測。3.3-羧基-γ-L-谷氨酰對硝基苯胺（GCNA）做底物，催化生成的2-硝基-5-氨基苯甲酸在堿性環(huán)境下呈黃色，可以連續(xù)監(jiān)測。γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶的測定

四（一）方法選擇與評價109現(xiàn)在是109頁\一共有118頁\編輯于星期三1.若反應(yīng)溫度37℃時最適pH則為7.702.5-氨基-2-硝基苯甲酸在410nm的摩爾消光系數(shù)為