蘭州大學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)演示文稿

蘭州大學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有53頁\編輯于星期三2023/4/17臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)與醫(yī)藥化工學(xué)院柯世省蘭州大學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)現(xiàn)在是2頁\一共有53頁\編輯于星期三一、化學(xué)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)反應(yīng)的兩個(gè)基本問題：（1）反應(yīng)進(jìn)行的方向、可能性和限度；（2）反應(yīng)進(jìn)行的速率和反應(yīng)機(jī)制。（一）反應(yīng)速率及其測定反應(yīng)速率是以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物或生成物濃度的改變來表示。用瞬時(shí)速率表示反應(yīng)速率：

v=dc/dt反應(yīng)速率的測定實(shí)際上就是測定不同時(shí)間的反應(yīng)物或生成物的濃度?，F(xiàn)在是3頁\一共有53頁\編輯于星期三（二）反應(yīng)分子數(shù)和反應(yīng)級(jí)數(shù)1.反應(yīng)分子數(shù)：在反應(yīng)中真正相互作用的分子的數(shù)目。單分子反應(yīng)，雙分子反應(yīng)，……判斷一個(gè)反應(yīng)是單分子反應(yīng)還是雙分子反應(yīng)，應(yīng)先了解反應(yīng)機(jī)制，即反應(yīng)過程中各個(gè)單元反應(yīng)是如何進(jìn)行的。2.反應(yīng)級(jí)數(shù)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，整個(gè)化學(xué)反應(yīng)的速率服從哪種分子反應(yīng)速率方程式，則這個(gè)反應(yīng)即為幾級(jí)反應(yīng)。一級(jí)反應(yīng)，二級(jí)反應(yīng)，……，零級(jí)反應(yīng)?，F(xiàn)在是4頁\一共有53頁\編輯于星期三（三）各級(jí)反應(yīng)的特征1.一級(jí)反應(yīng)凡是反應(yīng)速率只與反應(yīng)物的濃度的一次方成正比的，這種反應(yīng)就稱為一級(jí)反應(yīng)。速率常數(shù)與半衰期成反比，半衰期與反應(yīng)物的初濃度無關(guān)。2.二級(jí)反應(yīng)凡是反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度二次方（或兩種物質(zhì)濃度的乘積）成正比的，這種反應(yīng)就稱為二級(jí)反應(yīng)。半衰期與初濃度成反比。3.零級(jí)反應(yīng)凡是反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度無關(guān)而受它種因素影響而改變的反應(yīng)。半衰期與初始濃度成正比?，F(xiàn)在是5頁\一共有53頁\編輯于星期三二、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響（一）中間絡(luò)合物學(xué)說1903年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的實(shí)驗(yàn)在低底物濃度時(shí),反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)特征。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)?，F(xiàn)在是6頁\一共有53頁\編輯于星期三酶與底物的中間絡(luò)合物學(xué)說（Henri和Wurtz）

S+EESP+E中間產(chǎn)物假說證據(jù)：（1）ES復(fù)合物已被電子顯微鏡和X射線晶體結(jié)構(gòu)分析直接觀察到。（2）酶和底物的光譜特性在形成ES后發(fā)生變化。（3）酶的物理性質(zhì)經(jīng)常在形成ES后發(fā)生變化。（4）已分離得到ES復(fù)合物。（5）平衡透析時(shí)，底物濃度在半透膜內(nèi)外不等?，F(xiàn)在是7頁\一共有53頁\編輯于星期三（二）酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程式1.米氏方程式的推導(dǎo)推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照“穩(wěn)態(tài)平衡”假說的設(shè)想進(jìn)行推導(dǎo)。米氏方程:米氏常數(shù):現(xiàn)在是8頁\一共有53頁\編輯于星期三米氏方程的推導(dǎo)令：將（4）代入（3），則：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：則：(1)經(jīng)整理得：由于酶促反應(yīng)速度由[ES]決定，即，所以(2)將（2）代入（1）得：(3)當(dāng)酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時(shí)：當(dāng)[E]=[ES]時(shí)，(4)所以

現(xiàn)在是9頁\一共有53頁\編輯于星期三酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線當(dāng)[S]<<Km時(shí)當(dāng)[S]＞＞Km時(shí)當(dāng)[S]=Km時(shí)現(xiàn)在是10頁\一共有53頁\編輯于星期三2.動(dòng)力學(xué)參數(shù)的意義（1）米氏常數(shù)的意義a.不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù),只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與其濃度無關(guān)。b.Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值。c.Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。（同一種酶有幾種底物就有幾個(gè)Km值，其中Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物）一般情況下，1/Km可以近似地表示酶對(duì)底物的親和力大小，1/Km愈大，表明親和力愈大?，F(xiàn)在是11頁\一共有53頁\編輯于星期三所以1/Km表示形成ES的趨勢(shì)大小特例：Km=K2/K1=Ks(在K3K1，K2時(shí))d.Km與Ks

Km不等于Ks。在K3<<K1、K2時(shí)，Km看作Ks，也只有此時(shí)1/Km

才可以近似表示酶與底物結(jié)合的難易程度。

e.Km與Km無抑制劑時(shí)，ES的分解速度與形成速度的比值符合米氏方程，為Km;而有抑制劑時(shí)發(fā)生變化，則不符合米氏方程，為Km?，F(xiàn)在是12頁\一共有53頁\編輯于星期三f.Km和米氏方程的實(shí)際應(yīng)用若已知某個(gè)酶的Km值，可以計(jì)算在某一個(gè)底物濃度時(shí)，反應(yīng)速度相當(dāng)于最大反應(yīng)速度的百分率。g.Km可以幫助推斷某一反應(yīng)的方向和途徑現(xiàn)在是13頁\一共有53頁\編輯于星期三（2）Vmax和k3(kcat)的意義在一定的酶濃度下，Vmax是一個(gè)常數(shù)，它只與底物的種類及反應(yīng)條件有關(guān)。當(dāng)[S]很大時(shí)，Vmax=K3[E]K3代表酶被底物飽和時(shí)每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，稱為轉(zhuǎn)換數(shù)（或催化常數(shù)，Kcat），表明酶的最大催化效率。轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)即為催化周期：一個(gè)酶分子每催化一個(gè)底物分子所需的時(shí)間。乳糖脫氫酶轉(zhuǎn)換數(shù)為1000/秒，則它的催化周期為10-3秒現(xiàn)在是14頁\一共有53頁\編輯于星期三（3）Kcat/Km

的意義在生理?xiàng)l件下，[S]/Km=0.01～1.0[S]<<Km時(shí)：Kcat/Km的上限是K1，即生成ES復(fù)合物的速度(酶促反應(yīng)的速度不會(huì)超過ES的形成速度K1，在水相中不會(huì)超過108～109）現(xiàn)在是15頁\一共有53頁\編輯于星期三只有Kcat/Km可以客觀地比較不同的酶或同一種酶催化不同底物的催化效率現(xiàn)在是16頁\一共有53頁\編輯于星期三3.利用作圖法測定Km和Vmax值（1）

Lineweaver-Burk

雙倒數(shù)作圖法米氏方程的雙倒數(shù)形式：基本原則：將米氏方程變化成相當(dāng)于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。1Km11—=——.—+——

vVmax

[S]Vmax

現(xiàn)在是17頁\一共有53頁\編輯于星期三（2）Eadie-Hofstee作圖法v～v/[S]作圖法v=Vmax

－Km·——v[S]v[S]vVmax-Km現(xiàn)在是18頁\一共有53頁\編輯于星期三（3）Hanes-Woolf作圖法——＝——＋——[S][S]vVmaxVmaxKm1Km11—=——.—+——

vVmax

[S]Vmax

在兩邊均乘以[S]：以～[S]作圖[S]v-Km[S]v[S]Vmax1現(xiàn)在是19頁\一共有53頁\編輯于星期三（4）Eisenthal作圖法現(xiàn)在是20頁\一共有53頁\編輯于星期三（三）多底物的酶促反應(yīng)1.多底物酶促反應(yīng)按動(dòng)力學(xué)機(jī)制分類①有序反應(yīng)只有Leadingsubstrate(領(lǐng)先底物A)首先與酶結(jié)合，然后B才能與酶結(jié)合，形成的三元復(fù)合物EAB（ternarycomplex)轉(zhuǎn)變?yōu)镋PQ，B的產(chǎn)物P先釋放，A的產(chǎn)物Q后釋放?！镌谌鄙貯時(shí)，B不能與E結(jié)合E+A+B→AEB→PEQ→E+P+Q（1）序列反應(yīng)現(xiàn)在是21頁\一共有53頁\編輯于星期三E→AE→AEB→QEP→QE→EABPQPEAAEAEBQEPBQEQA與其產(chǎn)物Q相互競爭地結(jié)合E，但A和B互不竟?fàn)幏磻?yīng)的總方向決定于A、Q的濃度和反應(yīng)的平衡常數(shù)現(xiàn)在是22頁\一共有53頁\編輯于星期三NAD＋與NADH相互競爭E上的NAD＋結(jié)合部位現(xiàn)在是23頁\一共有53頁\編輯于星期三②隨機(jī)反應(yīng)底物A、B與酶結(jié)合的順序是隨機(jī)的，形成的三元復(fù)合物AEB→QEP，產(chǎn)物P、Q的釋放順序也是隨機(jī)的。限速步驟是AEB→QEPA與Q相互競爭E上的底物結(jié)合部位A，B與P相互競爭E上的底物結(jié)合部位B反應(yīng)的總方向決定于A、B、Q、P的濃度和反應(yīng)的平衡常數(shù)現(xiàn)在是24頁\一共有53頁\編輯于星期三（2）乒乓反應(yīng)底物A先與E結(jié)合成AE二元復(fù)合物，AE→PF（修飾酶形式），釋放第一個(gè)產(chǎn)物P，接著底物B與F形成FB，F(xiàn)B→EQ，釋放第二個(gè)產(chǎn)物Q。A與Q競爭自由酶形式E，B與P競爭修飾酶形式F。整個(gè)反應(yīng)歷程中只有二元復(fù)合物形式，沒有三元復(fù)合物形式?，F(xiàn)在是25頁\一共有53頁\編輯于星期三2.雙底物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程（1）乒乓機(jī)制的動(dòng)力學(xué)方程KmA：[B]達(dá)到飽和濃度時(shí)A的米氏常數(shù)KmA′：A的表觀米氏常數(shù)Vmax：[A][B]都達(dá)到飽和濃度時(shí)的最大反應(yīng)速度現(xiàn)在是26頁\一共有53頁\編輯于星期三★乒乓機(jī)制的動(dòng)力學(xué)曲線是兩組平行直線★表觀米氏常數(shù)KmA′（KmB′）隨[B]（[A]）濃度的增大而增大★表觀最大反應(yīng)速度Vmax′隨[B]（[A]）的增大而增大現(xiàn)在是27頁\一共有53頁\編輯于星期三（2）序列機(jī)制的底物動(dòng)力學(xué)方程現(xiàn)在是28頁\一共有53頁\編輯于星期三★序列機(jī)制的動(dòng)力學(xué)曲線是兩組相交直線（交于X軸負(fù)側(cè)）★交點(diǎn)在X軸：表觀KmA′（KmB′）不隨[[B]（[A]）濃度變化而變化（KmA′=KmA、KmB′=KmB）★交點(diǎn)在X軸上：表觀KmA′（KmB′）隨[[B]（[A]）濃度的增加而減小★交點(diǎn)在X軸下：表觀KmA′（KmB′）隨[[B]（[A]）濃度的增加而增大★表觀最大反應(yīng)速度Vmax′隨[B]（[A]）的增大而增大現(xiàn)在是29頁\一共有53頁\編輯于星期三三、酶的抑制作用變性作用(denaturation)：抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或喪失但并不引起酶蛋白變性變性劑沒有選擇性抑制劑有不同程度的選擇性研究抑制劑對(duì)酶的作用有重大的意義：（1）藥物作用機(jī)理和抑制劑型藥物的設(shè)計(jì)與開發(fā)（2）了解生物體的代謝途徑，進(jìn)行人為調(diào)控或代謝控制發(fā)酵（3）通過抑制劑試驗(yàn)研究酶活性中心的構(gòu)象及其化學(xué)功能基團(tuán)，不僅可以設(shè)計(jì)藥物，而且也是酶工程和化學(xué)修飾酶、酶工業(yè)的基礎(chǔ)現(xiàn)在是30頁\一共有53頁\編輯于星期三（一）抑制程度的兩種表示方法1、相對(duì)活力★相對(duì)活力分?jǐn)?shù)★相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)2、抑制率★抑制分?jǐn)?shù)★抑制百分?jǐn)?shù)現(xiàn)在是31頁\一共有53頁\編輯于星期三（二）抑制作用的類型1、不可逆的抑制作用抑制劑與酶活性中心（外）的必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶的活性下降，無法用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活。2、可逆的抑制作用

抑制劑與酶蛋白非共價(jià)鍵結(jié)合，可以用透折、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活。現(xiàn)在是32頁\一共有53頁\編輯于星期三（1）競爭性抑制（Competitiveinhibition）

抑制劑具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，競爭酶的活性中心，并與酶形成可逆的EI復(fù)合物，阻止底物與酶結(jié)合?？梢酝ㄟ^增加底物濃度而解除此種抑制?，F(xiàn)在是33頁\一共有53頁\編輯于星期三（2）非競爭性抑制（noncompetitiveinhibition）底物和抑制劑可以同時(shí)與酶結(jié)合，但是，中間的三元復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，因此，酶的活性降低。抑制劑與酶活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合，其結(jié)構(gòu)可能與底物無關(guān)。不能通過增加底物濃度的辦法來消除非競爭性抑制作用?，F(xiàn)在是34頁\一共有53頁\編輯于星期三（3）反競爭性抑制酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合。E+S→ES+I→ESI≠P常見于多底物的酶促反應(yīng)中現(xiàn)在是35頁\一共有53頁\編輯于星期三（三）可逆抑制作用與不可逆抑制作用的鑒別1、通過透析、超濾、凝膠過濾等2、通過v-E速度曲線[E]v123(1)反應(yīng)體系中不加I。(2)反應(yīng)體系中加入一定量的不可逆抑制劑。(3)反應(yīng)體系中加入一定量的可逆抑制劑?，F(xiàn)在是36頁\一共有53頁\編輯于星期三[E]v不可逆抑制劑的作用[E]v

可逆抑制劑的作用[I]增高→[I]增高3、通過可逆抑制劑的動(dòng)力學(xué)曲線可以區(qū)分三種可逆抑制作用現(xiàn)在是37頁\一共有53頁\編輯于星期三（四）可逆抑制作用動(dòng)力學(xué)1、競爭性抑制動(dòng)力學(xué)方程：（Ki為EI的解離常數(shù)）★Vmax不變;Km變大，而且隨[I]濃度的增大而增大?，F(xiàn)在是38頁\一共有53頁\編輯于星期三2、非競爭性抑制動(dòng)力學(xué)方程：★Km不變，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）現(xiàn)在是39頁\一共有53頁\編輯于星期三3、反競爭性抑制動(dòng)力學(xué)方程：★Km及Vmax都變小現(xiàn)在是40頁\一共有53頁\編輯于星期三可逆抑制的動(dòng)力學(xué)比較抑制類型Vmax變化Km變化無抑制劑//競爭性抑制作用不變變大非競爭性抑制作用變小不變

反競爭性抑制作用變小變小現(xiàn)在是41頁\一共有53頁\編輯于星期三（五）一些重要的抑制劑1、不可逆抑制劑：（1）非專一性不可逆抑制劑

與酶的活性中心以及活性中心外的某一類或幾類必需基團(tuán)反應(yīng)①有機(jī)磷的酰化物二異丙基磷酰氟（DFP，神經(jīng)毒氣）和許多有機(jī)磷農(nóng)藥。抑制機(jī)理：與蛋白酶及酯酶活性中心Ser的—OH形成磷脂鍵。毒理：強(qiáng)烈抑制乙酰膽堿脂酶（神經(jīng)毒劑）。

解毒劑：PAM（解磷定）可以把酶上的磷酰基團(tuán)除去?，F(xiàn)在是42頁\一共有53頁\編輯于星期三②有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物抑制機(jī)理：使酶的巰基烷化毒理：主要與還原型硫辛酸輔酶反應(yīng)，抑制丙酮酸氧化酶系統(tǒng)。解毒劑：二巰基丙醇（BAL）、Cys、GSH等過量的巰基化合物?，F(xiàn)在是43頁\一共有53頁\編輯于星期三③重金屬Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多數(shù)酶失活，EDTA可解除。④、烷化物★含鹵素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、鹵乙酰苯等）常用于鑒定酶中巰基。⑤氰化物、硫化物、CO與含鐵卟啉的酶中的Fe2+結(jié)合，阻抑細(xì)胞呼吸現(xiàn)在是44頁\一共有53頁\編輯于星期三⑥青霉素不可逆抑制糖肽轉(zhuǎn)肽酶⑦還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等巰基試劑還原酶的二硫鍵、含活潑雙鍵試劑（與—ＳＨ、—ＮＨ２反應(yīng)）Ｎ—乙基順丁烯二酰亞胺

⑧親電試劑四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。

現(xiàn)在是45頁\一共有53頁\編輯于星期三（2）專一性不可逆抑制劑此類抑制劑僅僅和某一種酶的活性部位的必需基團(tuán)反應(yīng)。①Ks型不可逆抑制劑（親和標(biāo)記試劑，親和修飾試劑）具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，同時(shí)還帶有一個(gè)能與酶活性中心或活性中心外的必需基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的活潑基團(tuán)。專一性程度取決于它與活性中心及活性中心外的的Ks之比。胰乳蛋白酶的最佳底物：對(duì)-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯Ks型不可逆抑制劑：對(duì)－甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）-CH2-Cl與酶活性部位的一個(gè)His-咪唑基距離很近，很易使之烷基化?，F(xiàn)在是46頁\一共有53頁\編輯于星期三②Kcat型不可逆抑制劑（自殺性底物）具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，不僅能與酶結(jié)合，而且潛伏的反應(yīng)基團(tuán)（latentreactivegroup）能被酶催化而活化，并與酶活性中心必需基團(tuán)進(jìn)行不可逆結(jié)合。

現(xiàn)在是47頁\一共有53頁\編輯于星期三2、可逆抑制劑★競爭性抑制劑

許多代謝類似物都是競爭性抑制劑，可用作抗菌藥和抗癌藥物?！锘前奉愃幬锛捌渥饔脵C(jī)理對(duì)氨基苯磺酰胺或其衍生物對(duì)氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物，