單克隆抗體技術(shù)

單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用魏婷婷（生命科學(xué)學(xué)院食品科學(xué)與工程發(fā)酵方向）摘要：本綜述包括以下內(nèi)容：簡要敘述了單克隆抗體發(fā)現(xiàn)歷史；系統(tǒng)地闡述單克隆抗體技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)；介紹單克隆抗體技術(shù)在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：單克隆抗體雜交瘤技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域引言單克隆抗體技術(shù)（monoclonalantibodytechnique）, 1975年英國科學(xué)家Milstein和Kohler所發(fā)明，并獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。1984德國人G.J.F.Kohler、阿根廷人C.Milstein[3]和丹麥科學(xué)家N.K.Jerne由于發(fā)展了單克隆抗體技術(shù),完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)而分享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。它是將產(chǎn)生抗體的單個B淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞雜交，獲得既能產(chǎn)生抗體，又能無限增殖的雜種細(xì)胞，并以此生產(chǎn)抗體的技術(shù)。其原理是:B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進(jìn)行無限分裂;而瘤細(xì)胞雖然可以在體外進(jìn)行無限傳代，但不能產(chǎn)生抗體。將這兩種細(xì)胞融合后得到的雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性。免疫反應(yīng)是人類對疾病具有抵抗力的重要因素。當(dāng)動物體受抗原刺激后可產(chǎn)生抗體?？贵w的特異性取決于抗原分子的決定簇，各種抗原分子具有很多抗原決定簇，因此，免疫動物所產(chǎn)生的抗體實(shí)為多種抗體的混合物。用這種傳統(tǒng)方法制備抗體效率低、產(chǎn)量有限，且動物抗體注入人體可產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。此外，要把這些不同的抗體分開也極困難近年，單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)，是免疫學(xué)領(lǐng)域的重大突破。單克隆抗體單克隆抗體的基本概念抗體主要由B淋巴細(xì)胞合成。每個B淋巴細(xì)胞有合成一種抗體的遺傳基因。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，含遺傳基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成該細(xì)胞的子孫，即克隆由許多個被激活B細(xì)胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多種抗體。如果能選出一個制造一種專一抗體的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成一種決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)的基本原理要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長。而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性，它既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來源于單個融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。應(yīng)用學(xué)科細(xì)胞生物學(xué)（一級學(xué)科）；細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程（二級學(xué)科）。單克隆抗體技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)單克隆抗體技術(shù)是生物技術(shù)的重要內(nèi)容之一。它不僅可與基因工程媲美，而且已與基因工程配合應(yīng)用，將更加發(fā)揮其重大作用。這是由它們的下列優(yōu)點(diǎn)所決定的：（一）用任何抗原、半抗原，包括各種細(xì)菌、激素、酶素、病原體、氨基酸序列、核酸，還有其他異體蛋白或糖蛋白等抗原物質(zhì)

都可以用雜交瘤技術(shù)獲得相應(yīng)的單克隆抗體。因而人們可以在體外或動物體內(nèi)按自己的需要，生產(chǎn)不同類型的單抗?，F(xiàn)在，已經(jīng)可以制出多種病毒、細(xì)菌、枝原體、霉菌、寄生蟲表面抗原，癌胚抗原，血型紅細(xì)胞抗原，移植抗原，腫瘤相關(guān)抗原，多種血清成份，DNA，RNA，基因片段等等單克隆抗體。已應(yīng)用單克隆抗體制成免疫熒光技術(shù)，酶免疫吸附實(shí)單克隆抗體技術(shù)及其在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的應(yīng)用。單克隆抗體的提純一般常用金黃色葡萄球菌蛋白A—瓊脂糖4B親和層析法。單克隆抗體的保存由腹水中獲得的抗體,經(jīng)離心去除細(xì)胞成分，再經(jīng)冷凍超速離心,取上清液加0.1%NaN3,少量分裝，冷凍于-70°C可保存幾年。但應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則抗體失活，特別是IgM抗體。提純的單克隆抗體，冷凍干燥保存于2?8C,取出時(shí)溶解后，保存于2?8C,至少一個月內(nèi)可保持穩(wěn)定。腹水抗體也可冷凍干燥低溫(4C)保存兩年，融化后放置4C下保存一個月。短期使用的腹水抗體，4C3?4個月仍保持穩(wěn)定，培養(yǎng)上清加0.1%NaN3,貯于-20C，兩年不失活性。生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)將經(jīng)預(yù)定抗原免疫的淋巴細(xì)胞與失去次黃嘌吟磷酸糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)合成能力的骨髓瘤細(xì)胞系細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)、篩選和克隆化，獲得既能分泌針對預(yù)定抗原的單抗又能無限制增殖的雜瘤細(xì)胞系，這就是淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)。雜交瘤技術(shù)的原理雜交瘤技術(shù)的原理可用(圖2)來說明。圖中的A為用預(yù)定抗原免疫的小鼠的脾淋巴細(xì)胞，B為HGPRT或TK小鼠骨髓瘤細(xì)胞，兩者在融合劑聚乙二醇存在時(shí)進(jìn)行融合。發(fā)生融合作用后的細(xì)胞混合物在含有次黃嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的選擇性培養(yǎng)基(HAT)中培養(yǎng)。PEGi 相便融 i 相便融 I柚計(jì)人合的A“響礎(chǔ)含相互楹HAT選擇含堆莽液中塔?蒂r*t I ti培養(yǎng)中占絕對優(yōu)勢的是未融合的A和未融合的B,有少數(shù)的A和B融合以及其少數(shù)的A-A融合和B-B融合。未融合的A和少數(shù)的A-A融合，畑有完整的DNA代謝系統(tǒng)，但因其本身是不能連續(xù)培養(yǎng)的短壽細(xì)胞，故很快死亡；未融合的B和少量的B-B融合，因其為TK或HGPRT的缺陷細(xì)胞，在HAT培養(yǎng)基中DNA代謝被完全阻斷，亦很快死亡；只有少量的A和B融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞，因得到來自脾淋巴細(xì)胞的DNA代謝旁路酶系統(tǒng)和來自骨髓瘤細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)特性的互補(bǔ)作用，而存

活迅速增殖。有些雜交瘤細(xì)胞來自分泌針對預(yù)定抗原體的B淋巴細(xì)胞，通過篩選（抗體檢測）和克隆化，即可建立生產(chǎn)單抗的雜交瘤細(xì)胞系。雜交瘤技術(shù)的程序用雜交瘤技術(shù)制備單抗的主要程序如（圖3）所示，包括動物免疫，細(xì)胞融合，雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化，單抗的鑒定等步驟?？磘ap細(xì)-看tap細(xì)-亙斥茫討定Nt富7T=廠廷扌石空上學(xué)旳護(hù)天了聲*}3.2.1動物免疫：需的單抗，但疫抗原可提高雜交瘤的陽性率，盡可能將免疫抗原提純。免疫動體分泌能力較穩(wěn)定。免需的單抗，但疫抗原可提高雜交瘤的陽性率，盡可能將免疫抗原提純。免疫動體分泌能力較穩(wěn)定。免大大減輕篩選的工作量。所以應(yīng)根據(jù)具體的抗原和實(shí)￡物以BALB/C小鼠最常用，因大多數(shù)小鼠骨髓細(xì)胞源于該系，疫程序直接影響融合率和雜交瘤細(xì)胞的陽性率，應(yīng)考慮抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時(shí)間、佐劑的使用及動物對該抗原的免疫應(yīng)答能力等。如希望得到針對非優(yōu)勢決定簇的單抗，或針對各種不同表位的單抗，則不宜作多次免疫。一般最后一次免疫取腹腔或靜脈途徑，3天后融合。細(xì)胞融合免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在PEG的促使下融合。影響細(xì)胞融合的因素很多，最重要的有骨髓細(xì)胞、聚乙二醇（PEG）培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。骨髓瘤細(xì)胞和有枝原體污染則不能產(chǎn)生雜交瘤。融合一周時(shí)間內(nèi)使骨髓瘤細(xì)胞一直處于對數(shù)生長的良好狀態(tài)是融合成功的關(guān)鍵之一。不同廠家和不同批次的PEG融合率差異很大，一般用分子的相對質(zhì)量1000?4000的PEG,工作濃度40%?50%,pH8.0?8.2，作用時(shí)間1?2min，雜交瘤細(xì)胞最適宜的條件是37°C,5%?8%吃CO2，95%飽和濕度，細(xì)胞融合前應(yīng)將co2孵箱調(diào)至最佳工作狀態(tài)。雜交瘤細(xì)胞篩選即把分泌針對預(yù)定抗原的抗體雜交瘤細(xì)胞篩選出來，通常亦稱抗體檢測，篩選雜交瘤的抗體檢測方法必須具有快速、準(zhǔn)確、簡便以及一次能處理大量樣品的特點(diǎn)，因?yàn)橥枰趲讉€小時(shí)內(nèi)報(bào)告幾百個樣品的檢測結(jié)果。一般說應(yīng)在融合之前建立好抗體檢測方法，并克服可能存在的問題。在設(shè)計(jì)檢測試驗(yàn)時(shí)充分認(rèn)識到單抗與多抗不同，用一種試驗(yàn)篩選出來的單抗，在不同類型的其它試驗(yàn)中可能沒有反應(yīng)，因此篩選的方法必須與單抗的最終用途相符合。雜交瘤細(xì)胞的克隆化所謂克隆化是指通過體外培養(yǎng)從混合細(xì)胞群體中得到單個細(xì)胞無性繁殖的群體。從原始孔中得到的分泌針對預(yù)定抗原的雜交瘤細(xì)胞可能不是單克隆性的，因此它們分泌的抗體不一定是同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單抗，必須對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。另一方面，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能已喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細(xì)胞，得到分泌抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞群體（又稱亞克?。?，也需要克隆化。此外，在液氮中長期凍存的雜交瘤細(xì)胞，復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，這時(shí)也需要克隆化。初次檢出陽性雜交瘤孔，一般連續(xù)進(jìn)行2~3次克隆化即可，有時(shí)則需要進(jìn)行多次。克隆化以有限烯釋法最為常用。單抗的鑒定為了正確使用單抗，在建株時(shí)應(yīng)對每種單抗與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性、單克隆性和理化特性等進(jìn)行鑒定。與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性鑒定，包括確定單抗所針對的抗原表位，確定單抗的特異性和交叉反應(yīng)性，確定單抗在不同免疫學(xué)試驗(yàn)中的反應(yīng)性。單克隆鑒定包括確定單抗重鏈和輕鏈類型，確定雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目和確定單抗的純度。理化特性鑒定的主要內(nèi)容是單抗對溫度和pH值變化的穩(wěn)定性，以及單抗的親和力，它們可為單抗的正確保存和使用提供依據(jù)。單抗的制備分泌特異單抗的雜交瘤細(xì)胞系在建立后通常凍存于液氮中，可隨時(shí)取出復(fù)蘇，用于制備單抗。在實(shí)驗(yàn)室少量制備單抗，通常用細(xì)胞培養(yǎng)法和激化BALB/C小鼠接種法。雜交瘤細(xì)胞不是嚴(yán)格的貼壁依賴細(xì)胞，它既可以進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng)，又可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。單層細(xì)胞培養(yǎng)是制備單抗最常用的實(shí)驗(yàn)室方法，因能達(dá)到的細(xì)胞密度極限為1?2X106/ml培養(yǎng)上清中的單抗?jié)舛葍H10?50ug/ml。用小鼠接種法制備單抗，先將BALB/C小鼠用降植烷或液體石蠟激化0.3ml/只腹腔注射），間隔7?10天后腹腔接種雜交瘤細(xì)胞2?5X105/只，再間隔5?7天采集腹水。通常每只小鼠可采5?10ml腹水，抗體含量在1?5mg/ml左右。單克隆抗體的應(yīng)用領(lǐng)域單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用單克隆抗體用于臨床診斷和治療，目前研究較多的是抗人T細(xì)胞單克隆抗體，用以識別人T細(xì)胞表面的不同抗原決定簇，有OKT系統(tǒng)及Leu系統(tǒng)。T細(xì)胞，特別是免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Ti/h及Tc/s細(xì)胞）對于調(diào)控免疫應(yīng)答和維持免疫自穩(wěn)起著至關(guān)重要的作用,臨床上許多疾病的發(fā)生與免疫調(diào)節(jié)失常有關(guān)，因此，研究T細(xì)胞在這些疾病中的變化，有助于探討病因和輔助診斷。各種免疫缺損病、腫瘤或感染性疾病都與免疫功能低下有關(guān)，而變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫性疾病等與免疫功能亢進(jìn)有關(guān)。因此應(yīng)用0KT系列單克隆抗體檢測這些疾病患者外周血中T細(xì)胞亞群及T4/T8比值的變化，對探討發(fā)病機(jī)理，及時(shí)診斷疾病及監(jiān)測病情發(fā)展有十分重要的意義。接受腎移植或骨髓移植的患者往往需應(yīng)用各種免疫抑制劑以控制排斥反應(yīng)，T細(xì)胞亞群的檢測有助于了解移植器官的排異和發(fā)展?？谷薚細(xì)胞單克隆抗體可用以治療白血病、移植物抗宿主反應(yīng)（GVHD）和急性腎排斥等，目前尚處于摸索階段。單克隆抗體在食品中的應(yīng)用單克隆抗體可辨認(rèn)抗原物質(zhì)結(jié)構(gòu)的微細(xì)差異，并和抗原發(fā)生特異性結(jié)合，用免疫分析技術(shù)能精確地測定抗原物質(zhì)的含量。單克隆抗體在食品中的應(yīng)用已在食品加工生產(chǎn)以及科學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。有關(guān)方面包括食品的成分，食品生產(chǎn)和加工，食品安全性以及食品成分在加工前后的分子水平上變化及其加工特性。單克隆抗體在乳品工業(yè)中的應(yīng)用單克隆抗體在乳品工業(yè)中主要用于牛奶份分析；形成牛奶正常和非正常風(fēng)味的微生物與酶的鑒定；牛奶中的病原微生物和毒素的檢測；加工工藝對牛奶蛋白結(jié)構(gòu)的影響以及牛奶中摻雜羊奶的識別。在牛奶中摻雜羊奶會嚴(yán)重影響乳酪的加工，因?yàn)榕Ｄ棠龎K的組成將影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)和加工特性。根據(jù)不同動物的免疫反應(yīng)不同，一種以抗牛奶酪蛋白的專一性抗體進(jìn)行的免疫斑點(diǎn)技術(shù)被建立。而且由于酪蛋白的耐熱性，這種方法對巴氏殺菌前后的牛奶或乳酪都能進(jìn)行分析。單克隆抗體在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用啤酒麥芽是啤酒的主要成分，用單克隆抗體可監(jiān)測大麥發(fā)芽和釀造過程的特性。此外，可用于檢出有害野生酵母以及各種途徑的污染物。一種熱穩(wěn)定蛋白被認(rèn)為對啤酒的泡沫穩(wěn)定性起著重要的作用，它在整個啤酒釀造過程中保持著抗原性，能被抗體認(rèn)別；用ELISA研究了麥芽制備、烘干、和搗碎過程對一種a-淀粉酶抑制劑BASI的抗原性的影響，發(fā)現(xiàn)制備過程對其只有很小的影響，烘干使其抗原性部分受損，而殘存的抗原性在50?70°C搗碎過程中幾乎全部喪失；用免疫擴(kuò)散技術(shù)鑒定了三種與起泡有關(guān)的蛋白，而且觀察到這些蛋白在煮沸時(shí)明顯減少。葡萄酒葡萄酒的生產(chǎn)依賴于兩個方面：葡萄的生產(chǎn)和葡萄的發(fā)酵。單克隆抗體已被用于診斷兩種主要危害葡萄酒的病毒GVF和AMV。要檢出發(fā)酵菌種中污染的野生酵母時(shí)，以胞壁特異性的多糖和蛋白質(zhì)為抗原制備成抗體的免疫學(xué)方法比電泳更快速、靈敏地檢出污染酵母。4.3單克隆抗體在肉品衛(wèi)生中的應(yīng)用肉品衛(wèi)生檢驗(yàn)是免疫學(xué)技術(shù)應(yīng)用的一個重要方面。沙門氏菌是肉品污染中一種典型的病原微生物。目前出現(xiàn)的許多快速檢測方法是利用酶免疫(EIA)方法。包括直接EIA夾心ELASA等。最新的檢測方法是采用特殊材料制成固相載體，聚酯布(Po-tyestercloth)結(jié)合單抗放置在層析柱的底部富集鼠傷寒沙門氏菌，然后直接做斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)；還有用單抗結(jié)合到磁性粒子(直徑上28nm)，用來檢測卵黃中的腸炎沙門氏菌，英國biomerienx公司最新推出了一種全自動ELASA沙門氏檢測系統(tǒng)，其原理是將捕捉抗體包被到凹形金屬片的內(nèi)面上，吸附被檢樣中的沙門氏菌。僅需把樣品加到測定試劑孔中，其余全部為自動分析，僅45分鐘，比傳統(tǒng)的方法省時(shí)、方便。4.4.單克隆抗體在食品儲藏中的應(yīng)用食品在儲藏過程中會受到霉菌等微生物的污染，其結(jié)果不僅導(dǎo)致感官品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值的降低，更重要的是某些霉菌能產(chǎn)生毒素。對霉菌的檢測一般采用培養(yǎng)、電導(dǎo)測量、測定耐熱物質(zhì)如幾丁質(zhì)以及顯微觀察等，均繁瑣而費(fèi)時(shí)，現(xiàn)在已從青霉、毛霉等霉菌中提取耐熱性抗原制成抗體。用ELASA方法可檢出加熱和未加熱的食品中的霉菌。黃曲霉素致癌、致突變物。對這種真菌毒素的免疫學(xué)分析方法有放射免疫分析(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附分析等。新一代ELASA引入一系列放大機(jī)制，使ELASA敏感性大為提高，如底物循環(huán)放大機(jī)制，使堿性磷酸酶不直接催化有色物質(zhì)生成，而是使NADP脫磷酸生成NAD,NAD進(jìn)入由醇脫氫酶和黃素酶催化的氧化還原循環(huán)，導(dǎo)致有色物質(zhì)的生成，這種放大機(jī)制使堿性磷酸酶的信號比標(biāo)準(zhǔn)ELASA放大了250倍。一種專一的競爭ELASA微量試驗(yàn)碟已被用于檢出黃曲霉素B1、B2