2021年大腸桿菌基因組DNA的提取及熒光定量PCR試驗(yàn)設(shè)計

大腸桿菌基因組DNA的提取歐陽光明(2021.03.07)一、傳統(tǒng)法提取大腸桿菌基因組DNA。1、實(shí)驗(yàn)原理提取DNA的一般過程是將分散好的組織細(xì)胞在含十二烷基硫酸鈉(SDS)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。SDS的作用機(jī)理是由于其能結(jié)合蛋白，中和蛋白的電性，使蛋白質(zhì)的非共價鍵受到破壞，失去二級結(jié)構(gòu)，從而變形失活，蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為光譜蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)存在的情況下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可通過失活蛋白破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白和DNA分離；而蛋白酶K可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，最后用無水乙醇沉淀DNA。為獲得高純度DNA，操作過程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB(十六烷基三乙基漠化銨)是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定的程度(0.3mol/LNaCl)時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB-核酸的復(fù)合物與蛋白，多糖物質(zhì)分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。2、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器1）實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌2）實(shí)驗(yàn)試劑：LB液體培養(yǎng)基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K,5mol/LNaCl,CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/異戊醇，異丙醇，70%乙醇3）實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫?fù)u床、低溫離心機(jī)、微量移液器、水浴鍋3、溶液配制1）LB液體培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)用膠化蛋白胨10g/L，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，去離子水。（攪拌溶解后，用5mol/LNaOH調(diào)pH至7.0.用去離子水定容100ml，用20/50ml搖瓶分裝5瓶，包扎好，在121C，1.034x105pa高壓下蒸汽滅菌20min.）2）TE緩沖液：1MTris溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加熱溶解）1Mtris-HClpH8.0溶液（取1MTris溶液160ml用分析純鹽酸調(diào)至Ph=8.0（需濃鹽酸約8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高壓滅菌備用）TE緩沖液（10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0，1MTris-HClBufferPH=8.05ml0.5MEDTAPH=8.01ml向燒杯中加入約400mlddH2O均勻混合；將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌，室溫保存）3）蛋白酶K:（20mg蛋白酶K溶于1ml無菌雙蒸水，-20°C備用）4）CTAB/NaCl溶液:（5%w/v,5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中，需加熱到65C使之溶解，然后室溫保存）4、實(shí)驗(yàn)方法步驟1、將大腸桿菌接種到滅菌好的LB培養(yǎng)基中，一級培養(yǎng)過夜，以10%的接種量進(jìn)行二級培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)期（4-6h）。2、取菌液1.5ml置于離心管中，以5000rpm冷凍離心1min，棄上清液3、加190ulTE懸浮沉淀，并加10ul10%SDS,搖勻直至溶液變粘稠4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混勻，37C保溫1小時。5、加30ul5mol/LNaCl,混勻。6、加30ulCTAB/NaCl溶液，混勻，65C保溫20min7、加入300ul酚/氯仿/異戊醇抽提（25：24:1），5000rmp離心10min8、取上清液，加入300ul氯仿/異戊醇（24:1）抽提，5000rmp離心10min9、取上清液，加入300ul的異丙醇，顛倒混勻，室溫下靜止10min，沉淀DNA，5000rmp離心10min10、加500ul70%乙醇洗沉淀，5000rmp離心10min11、棄上清液，待酒精揮發(fā)盡后加30ulTE溶解12、溶解于20ulTE中，-20C保存。二、試劑盒法提取大腸桿菌基因組DNA。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：1、TGuide細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302-0250次420元2、TaKaRa細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒TaKaRaDV810A50650元3、Biomiga細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒GD2411-01BacterialgDNAkit50次423元GD2411-02BacterialgDNAkit250次1798元4、Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒BSC12S150次400元BSC12M1100次750元5、OMEGA細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒D3350-00E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit5210元D3350-01E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit50980元D3350-02E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit2003350元熒光定量PCR試驗(yàn)（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）定量實(shí)驗(yàn)是一種實(shí)時實(shí)驗(yàn)，用于在聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的每個擴(kuò)增循環(huán)期間測定靶核苷酸序列（靶）數(shù)量。其中靶可以是DNA、cDNA或RNA。【實(shí)驗(yàn)原理】在實(shí)時定量實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)是在PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增達(dá)到固定熒光水平時的循環(huán)期間時間點(diǎn)來描述的，而不是在固定循環(huán)次數(shù)后累積的PCR產(chǎn)物最終數(shù)量來描述。擴(kuò)增曲線以圖形形式顯示在執(zhí)行的循環(huán)次數(shù)中檢測到的熒光。在PCR的最初幾次循環(huán)中，熒光信號沒有明顯變化。該預(yù)定義的PCR循環(huán)范圍稱為基線。首先，軟件通過計算歸一化報告熒光信號強(qiáng)度（與基線循環(huán)相對應(yīng)的Rn值）的數(shù)學(xué)趨勢，生成一個基線簡化擴(kuò)增曲線。然后，算法將搜索擴(kuò)增曲線上基線校準(zhǔn)后歸一化報告熒光信號強(qiáng)度（deltaRn[ARn]值）與閾值交叉的點(diǎn)。ARn值與閾值交叉的分?jǐn)?shù)循環(huán)定義為CT。一、試驗(yàn)設(shè)計使用StepOne軟件中的DesignWizard（設(shè)計導(dǎo)向）創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)1、定義實(shí)驗(yàn)屬性在ExperimentProperties（實(shí)驗(yàn)屬性）屏幕上，輸入實(shí)驗(yàn)的標(biāo)識信息，然后選擇要設(shè)計的實(shí)驗(yàn)類型。1）ExperimentName（實(shí)驗(yàn)名稱）。2）Barcode（條碼），然后輸入您的PCR反應(yīng)板上的條碼。（可不填）3）UserName（用戶名）。4）Comments（注釋）。（可不填）5）選擇Quantitation（定量）實(shí)驗(yàn)類型6）Next>（下一步）2、定義方法和材料在Methods&Materials（方法和材料）屏幕上，選擇用于實(shí)驗(yàn)的定量方法、試劑、升降溫速度和PCR模板。1）將StandardCurve（標(biāo)準(zhǔn)曲線）選為定量方法。將StandardCurve（標(biāo)準(zhǔn)曲線）選為定量方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)確定樣本中靶序列的絕對量。從已知量的稀釋序列中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于歸檔結(jié)果。當(dāng)設(shè)置反應(yīng)板時，標(biāo)準(zhǔn)曲線方法需要靶、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本。用于標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)的PCR反應(yīng)包括以下組分：?樣本-其中靶數(shù)量未知的樣本。?標(biāo)準(zhǔn)品-數(shù)量已知的樣本。?標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列-一組用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（例如，1:2、1:4、1:8、1:16、1:32）。?重復(fù)數(shù)-含有相同組分和量的相同反應(yīng)數(shù)。?陰性對照-含有水或緩沖液的樣本，不含模板；也稱為“無模板對照（NTC）”。陰性對照應(yīng)不會擴(kuò)增。2）為試劑選擇TaqMan?Reagents（TaqMan試劑）（包括兩個引物一個探針）。-如果使用TaqMan試劑以檢測擴(kuò)增并定量樣本中靶的數(shù)量，則選擇TaqMan?Reagents（TaqMan試劑）。TaqMan試劑包括兩個引物和一個TaqMan?探針。引物設(shè)計用于擴(kuò)增靶。TaqMan探針設(shè)計用于雜交靶，并在擴(kuò)增靶時產(chǎn)生熒光信號。切記！AppliedBiosystems不建議將TAMRATM染料隨StepOneTM系統(tǒng)用作熒光報告基團(tuán)或淬火基團(tuán)。-如果使用SYBRGreen試劑以檢測擴(kuò)增并定量樣本中靶的數(shù)量，則選擇SYBR?GreenReagents（SYBRGreen試劑）。SYBRGreen試劑包括兩個引物和SYBRGreen染料。引物設(shè)計用于擴(kuò)增靶。SYBRGreen染料可在結(jié)合到雙鏈DNA時產(chǎn)生熒光信號。SYBRGreen染料通常是添加到反應(yīng)的SYBRGreen母液的一部分。如果使用SYBRGreen染料：選擇IncludeMeltCurve（包括解鏈曲線）以執(zhí)行擴(kuò)增靶的解鏈曲線分析。將Standard（標(biāo)準(zhǔn)）選為升降溫速度。AppliedBiosystems不提供SYBRGreen試劑的Fast母夜。3）為升降溫速度選擇Standard（~2hourstocompletearun）（標(biāo)準(zhǔn)（約兩小時完成運(yùn)行））。-如果為PCR反應(yīng)使用Fast試齊U,則選擇Fast（~40MinutestoCompleteaRun）（快速（約40分鐘完成運(yùn)行））。-如果為PCR反應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)試劑（包括SYBRGreen試劑和TaqMan試劑），則選擇Standard（~2HourstoCompleteaRun）（標(biāo)準(zhǔn)（約2小時完成運(yùn)行））。4）為模板類型選擇gDNA（genomicDNA）（gDNA（基因組DNA））。5）Next>（下一步）。3、設(shè)置靶在Targets（靶）屏幕上，輸入您想在PCR反應(yīng)板中定量的靶數(shù)量，然后為每個靶設(shè)置檢測。1）單擊Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinthereactionplate?（您想在反應(yīng)板中定量多少靶？）字段，然后輸入1（根據(jù)布女炊）。注意：靶檢測表中的行數(shù)將以您輸入的數(shù)字更新。2）選擇SetUpStandards（設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品）復(fù)選框，以為靶檢測設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品。建議反應(yīng)板中的每個靶檢測設(shè)置一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：SetUpStandards（設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品）復(fù)選框默認(rèn)情況下已選取。3）設(shè)置靶1檢測：單擊EnterTargetName（輸入靶名稱）單元格，然后輸入RNaseP（示例）。從Reporter（報告基團(tuán)）下拉菜單中，選擇FAM（默認(rèn)）。-如果要將FAMTM染料加在您用于檢測靶的TaqMan探針的5端，則選擇FAM。*歐陽光明*創(chuàng)編-如果要將JOETM染料加在您用于檢測靶的TaqMan探針的5端，則選擇JOE。-如果要將VIC?染料加在您用于檢測靶的TaqMan探針的5端，則選擇VIC。-如果您正使用SYBR?Green染料以檢測雙鏈DNA，則選擇SYBR。從Quencher（淬火基團(tuán)）下拉菜單中，選擇NFQ-MGB（默認(rèn)）。-如果要將非熒光淬火基團(tuán)-小溝結(jié)合物加在您正用于檢測靶的TaqMan探針的3,端，則選擇NFQ-MGB。-如果您正使用SYBRGreen染料，則選擇None（無）。4）Next>（下一步）。4、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品在Standards（標(biāo)準(zhǔn)品）屏幕上，為所有標(biāo)準(zhǔn)曲線輸入反應(yīng)板中的點(diǎn)數(shù)和重復(fù)數(shù)。對于每條標(biāo)準(zhǔn)曲線，輸入起始量并選擇序列倍數(shù)。1）單擊Howmanypointsdoyouneedforeachstandardcurve?（每條標(biāo)準(zhǔn)曲線您需要多少個點(diǎn)？）字段，然后輸入5。建議每條標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)至少有五個稀釋點(diǎn)。2）單擊Howmanyreplicatesdoyouneedforeachpoint?（每個點(diǎn)您需要多少次重復(fù)反應(yīng)？）字段，然后輸入3。建議每個點(diǎn)三次重復(fù)反應(yīng)。3）為RNaseP（示例）檢測定義標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量范圍：單擊EnterStartingQuantity（輸入起始量）字段，然后輸入10000O由于標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量的范圍會影響擴(kuò)增效率計算，因此應(yīng)仔細(xì)為您的檢測考慮標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量的適當(dāng)范圍：-為了更準(zhǔn)確地測量擴(kuò)增效率，請使用大范圍的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量，擴(kuò)大到5個至6個對數(shù)級之間。如果您為標(biāo)準(zhǔn)品指定大范圍的數(shù)量，您需使用PCR產(chǎn)物或高度濃縮的模板，如cDNA克隆。-如果您的cDNA模板數(shù)量有限且/或靶是低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)錄物，或已知在給定范圍之內(nèi)，則可能需要小范圍的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量。從SelectSerialFactor（選擇序列倍數(shù)）下列菜單中，選擇1:2o序列倍數(shù)用于計算標(biāo)準(zhǔn)曲線所有點(diǎn)中的數(shù)量。如果您的起始數(shù)量是最高數(shù)量，則選擇如1：2、1:3之類的稀釋倍數(shù)。如果您的起始數(shù)量是最低數(shù)量，則選擇如2X、3X之類的濃縮倍數(shù)。4）查看StandardCurvePreview（標(biāo)準(zhǔn)品曲線預(yù)覽）窗格。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)包含如下點(diǎn)：10000、5000、2500、1250和625。5）Next>（下一步）。5、設(shè)置樣本在Samples（樣本）屏幕上，輸入反應(yīng)板中要包括的樣本、重復(fù)數(shù)和陰性對照數(shù)，然后選擇樣本/靶反應(yīng)以進(jìn)行設(shè)置。1）單擊Howmanysamplesdoyouwanttotestinthereactionplate?（您想在反應(yīng)板中檢測多少樣本？）字段，然后輸入2。（根據(jù)需要填）2）單擊Howmanyreplicatesdoyouneed?（您需要多少次重復(fù)反應(yīng)？）字段，然后輸入3。建議對每個樣本反應(yīng)重復(fù)三次反應(yīng)。3）單擊Howmanynegativecontrolsdoyouneedforeachtargetassay?（每個靶檢測您需要多少陰性對照？），然后輸入3。建議對每個靶檢測進(jìn)行三次陰性對照反應(yīng)。4）4.設(shè)置樣本1:單擊EnterSampleName（輸入樣本名）字段，然后輸入pop1（用于重復(fù)組1）。保留Color（顏色）字段中的默認(rèn)設(shè)置。5）設(shè)置樣本2：單擊EnterSampleName（輸入樣本名）字段，然后輸入pop2（用于重復(fù)組2）。保留Color（顏色）字段中的默認(rèn)設(shè)置。6）選擇AllSample/TargetReactions（所有樣本/靶反應(yīng)）以檢測所有樣本中的所有靶。-選擇AllSample/TargetReactions（所有樣本/靶反應(yīng)）以檢測所有樣本中的所有靶。*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07-選擇SpecifySample/TargetReactions（指定樣本/靶反應(yīng)）以指定每個樣本中要檢測的靶。7）在WellCount（反應(yīng)孔數(shù)）窗格中，確認(rèn)存在：6個未知反應(yīng)孔U15個標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)孔S3個陰性對照反應(yīng)孔N24個空反應(yīng)孔8）在ViewPlateLayout（查看檢測板布局）選項(xiàng)卡上：從ArrangePlateby（反應(yīng)板布局方式）下拉菜單中，選擇Rows（按行）（默認(rèn)）。從PlaceNegativeControls（放置陰性對照）下拉菜單中，選擇UpperLeft（左上角）（默認(rèn)）。9）Next>（下一步）。6、設(shè)置運(yùn)行方式在RunMethod（運(yùn)行方法）屏幕上，查看默認(rèn)運(yùn)行方法的反應(yīng)體積和溫度變化過程設(shè)置。若需要，您可調(diào)整默認(rèn)運(yùn)行方法或用RunMethod（運(yùn)行方法）庫中的某種方法進(jìn)行替換。1）單擊選擇GraphicalView（圖形視圖）選項(xiàng)卡（默認(rèn)）或TabularView（表格視圖）選項(xiàng)卡。2）單擊ReactionVolumePerWell（每個反應(yīng)孔的反應(yīng)體積）字段，然后輸入25）1L。為“反應(yīng)體積/反應(yīng)孔”輸入介于10至30的值。StepOne系統(tǒng)支持10至30|1L之間的反應(yīng)體積。3）確保溫度變化過程設(shè)置顯示保持和循環(huán)階段。-確保溫度變化過程設(shè)置適合試劑。-如果正執(zhí)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，則包括一個反轉(zhuǎn)錄步驟。如果實(shí)驗(yàn)需要一個不同的溫度變化過程設(shè)置，調(diào)整溫度變化過程設(shè)置或用RunMethod（運(yùn)行方法）庫中的某個溫度變化過程設(shè)置進(jìn)行替換。RunMethod（運(yùn)行方法）庫包括在StepOne軟件中。4）Next>（下一步）。7、查看反應(yīng)設(shè)置在ReactionSetup（反應(yīng)設(shè)置）屏幕上，選擇檢測類型（如果使用TaqMan試劑），然后查看為準(zhǔn)備PCR反應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)稀釋序列和樣本稀釋而計算的劑量。若需要，您可調(diào)整反應(yīng)體積、額外反應(yīng)體積、組分濃度、標(biāo)準(zhǔn)品濃度和/或稀釋后樣本濃度。切記！對反應(yīng)板中的每個靶檢測執(zhí)行這些步驟。完成ReactionMixCalculations（反應(yīng)預(yù)混液計算）選項(xiàng)卡1）選擇ReactionMixCalculations（反應(yīng)預(yù)混液計算）選項(xiàng)卡（默認(rèn)）。2）從SelectTarget（選擇靶）窗格中，選擇RNaseP。3）從AssayType（檢測類型）下拉菜單中1，選擇（庫存/定制）。Inventoried/MadetoOrder*歐陽光明*創(chuàng)編（庫存/定制）。*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07如果正使用TaqMan試劑，選擇所使用的檢測類型：-如果正使用AppliedBiosystemsTaqMan?GeneExpressionAssays（庫存/定制）或AppliedBiosystemsCustomTaqMan?GeneExpressionAssays，則選擇Inventoried/MadetoOrder（庫存/定制）。-如果正使用PrimerExpress?軟件設(shè)計檢測，則選擇Custom（定制）。4）確認(rèn)ReactionVolumePerWell（每個反應(yīng)孔的反應(yīng)體積）字段中顯示25^Lo為“反應(yīng)體積/反應(yīng)孔”輸入介于10至30的值。StepOne系統(tǒng)支持10至30）1L之間的反應(yīng)體積。5）確認(rèn)ExcessReactionVolume（額夕卜反應(yīng)體積）字段中顯示10%o包括額外反應(yīng)體積以彌補(bǔ)移液過程中的損失。建議至少準(zhǔn)備10%的額外反應(yīng)體積。6）在ReactionsforRNaseP（RNaseP反應(yīng)）窗格中＞:確認(rèn)MasterMixConcentration（母液濃度）字段中顯示2.0Xo確認(rèn)AssayMixConcentration（檢測預(yù)混液濃度）字段中顯示20.0X。查看PCR反應(yīng)的組分和計算的劑量。7）在StandardDilutionSeriesforRNaseP（RNaseP的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列）窗格中：單擊StandardConcentrationinStock（儲液中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度）字段，然后輸入20000。單擊units（單位）字段，然后輸入copiesperpL。查看為準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列計算的劑量。完成SampleDilutionCalculations（樣本稀釋計算）選項(xiàng)卡1）選擇SampleDilutionCalculations（樣本稀釋計算）選項(xiàng)卡。2）單擊DilutedSampleConcentration（10XforReactionMix）（稀釋后樣本濃度）（對于反應(yīng)預(yù)混液為10X），然后輸入6.6。3）從單位下拉菜單中，選擇ng/pL（默認(rèn)）。4）查看為樣本稀釋計算的劑量。8、實(shí)驗(yàn)材料訂購在MaterialsList（材料列表）屏幕上，查看建議用于準(zhǔn)備PCR反應(yīng)板的材料列表。或者，您可從AppliedBiosystemsStore（AppliedBiosystems產(chǎn)品倉庫）訂購所建議的材料。創(chuàng)建購物籃，向購物列表中添加項(xiàng)目，然后登錄以提交您的訂單。您必須具有不受限制的網(wǎng)絡(luò)連接才能訪問AppliedBiosystemsStore（AppliedBiosystems產(chǎn)品倉庫）。1）在AppliedBiosystemsStore（AppliedBiosystems產(chǎn)品倉庫）網(wǎng)站上查找靶檢測套件：確保您的計算機(jī)已連接到因特網(wǎng)。單擊EnterGeneName（輸入基因名）字段，輸入RNaseP,然后單擊FindAssay（查找檢測套件）。在FindAssayResults（發(fā)現(xiàn)檢測套件結(jié)果）對話框中，選擇您的檢測套件。單擊ApplyAssaySelection（應(yīng)用檢測套件選擇）。2）完成ExperimentMaterialsList（實(shí)驗(yàn)材料列表）窗格：從Display（顯示）下拉菜單中，選擇AllItems（所有項(xiàng)）（默認(rèn)），然后查看建議的材料。若需要，使用右側(cè)的滾動條查看所有項(xiàng)。3）用于進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)的Inventoried/MadetoOrder檢測設(shè)計用于配合以下TaqMan?母液使用：TaqMan?FastUniversalPCRMasterMix（2X）,NoAmpErase?UNG，250次反應(yīng)，編號4352042TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix，200次反應(yīng)，編號4304437TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix，2000次反應(yīng)，編號432670810包裝TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix，編號4305719TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix,NoAmpErase?UNG，200次反應(yīng)，編號4324018TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix,NoAmpErase?UNG,2000次反應(yīng)，編號432661410包裝TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix，NoAmpErase?UNG，編號4324020靶DNA或cDNA有幾種TaqMan和SYBRGreen試劑可用于定量實(shí)驗(yàn)。TaqMan?試劑TaqMan?FastUniversalPCRMasterMix(2X),NoAmpErase?UNG，250次反應(yīng)4352042TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix，200次反應(yīng)，編號4304437TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix，2000次反應(yīng)，編號432670810包裝TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix，編號4305719TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix,No，AmpErase?UNG，200次反應(yīng)，編號4324018TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix,NoAmpErase?UNG，2000次反應(yīng)，編號432661410包裝TaqMan?2XUniversalPCRMasterMix，NoAmpErase?UNG，編號4324020TaqMan?PCRCoreReagentsKit，200次反應(yīng)，編號N808-0228SYBR?Green試劑PowerSYBR?GreenPCRMasterMix（1mL）,40次反應(yīng)，編號4368577PowerSYBR?GreenPCRMasterMix（5-mL），200次反應(yīng)，編號4367659PowerSYBR?GreenPCRMasterMix（10x5-mL）,2000次反應(yīng)，編號4368708PowerSYBR?GreenPCRMasterMix（50mL），2000次反應(yīng)，編號4367660SYBR?GreenPCRMasterMix（1-mL），40次反應(yīng)，編號4344463SYBR?GreenPCRMasterMix（5-mL），200次反應(yīng)，編號4309155SYBR?GreenPCRMasterMix（50-mL），2000次反應(yīng)，編號4334973SYBR?GreenPCRCoreReagents，200次反應(yīng)，編號43048869、完成設(shè)計向?qū)б瓿蒁esignWizard（設(shè)計向?qū)В┕ぷ髁鞒蹋榭捶磻?yīng)板布局，然后選擇一個退出選項(xiàng)。1）在ReviewPlateforExperiment（查看實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)板）窗口中，查看反應(yīng)板布局。2）單擊SaveExperiment（保存實(shí)驗(yàn)）。3）在SaveExperiment（保存實(shí)驗(yàn)）對話框中，單擊Save（保存）以接受默認(rèn)文件名和位置。示例實(shí)驗(yàn)被保存并關(guān)閉，并且您返回到Home（主頁）屏幕。二、準(zhǔn)備反應(yīng)工作如何為標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備PCR反應(yīng)。1、準(zhǔn)備樣本稀釋在將樣本添加到最終反應(yīng)預(yù)混液之前，執(zhí)行樣本稀釋。采用StepOneTM軟件計算的劑量稀釋樣本。（樣本稀釋計算）根據(jù)儲液中的樣品濃度？ng/pL，Stepone軟件計算出稀釋劑量。因?yàn)樵赟tepOne軟件中，樣本量僅限于反應(yīng)總量的10%，因此需要進(jìn)行樣本稀釋。反應(yīng)總量為每次反應(yīng)25pL，因此樣本量為每次反應(yīng)2.5pL。根據(jù)“樣本稀釋計算”表稀釋樣本。1）所需材料用于稀釋樣本的稀釋液（TE緩沖液或水）、樣本儲液微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機(jī)2）為每份擬稀釋樣本標(biāo)記一個單獨(dú)的微量離心管：Population1、Population2等3）將所需劑量的稀釋液添加到每個空反應(yīng)管內(nèi)°（14.2pL）4）將所需劑量的樣本儲液添加到每個反應(yīng)管內(nèi)°（1pL）5）振蕩每份稀釋的樣本3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。6）將稀釋后樣本置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。2、準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列采用StepOne軟件計算的劑量準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列。（反應(yīng)預(yù)混液計算）根據(jù)儲液中的標(biāo)準(zhǔn)品濃度？copies/pL，Stepone軟件計算出劑量。1）所需材料用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液（TE緩沖液或水）、標(biāo)準(zhǔn)品儲液微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機(jī)2）為每份標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記一個單獨(dú)的微量離心管：Std.1、Std.2、Std.3、Std.4、Std.5。3）將所需劑量的稀釋液添加到每個空反應(yīng)管內(nèi)：Std.1（14.5|iL）、Std.2（9.1|iL）、Std.3（9.1|iL）、Std.4（9.1|iL）、Std.5（9.1|iL）。4）在Std.1反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液1：振蕩儲液3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。使用新的移液槍槍頭，將3.6|1L儲液添加到Std.1反應(yīng)管中。振蕩Std.1反應(yīng)管3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。5）在Std.2反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液2：使用新的移液槍槍頭，將9.1|1L稀釋液1添加到Std.2反應(yīng)管中。b.振蕩Std.2反應(yīng)管3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。6）在Std.3反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液3:使用新的移液槍槍頭，將9.1|1L稀釋液2添加到Std.3反應(yīng)管中。b.振蕩Std.3反應(yīng)管3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。7）在Std.4反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液4：使用新的移液槍槍頭，將9.1|1L稀釋液3添加到Std.4反應(yīng)管中。振蕩Std.4反應(yīng)管3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。8）在Std.5反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液5:a.使用新的移液槍槍頭，將9.1|1L稀釋液4添加到Std.5反應(yīng)管中。振蕩Std.5反應(yīng)管3至5秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。9）將標(biāo)準(zhǔn)品置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。3、準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液使用StepOne軟件計算的組分和劑量準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液。（反應(yīng)預(yù)混液計算）若實(shí)驗(yàn)包括一個以上的靶檢測，則為每個靶檢測單獨(dú)準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液1）所需材料各反應(yīng)預(yù)混液組分微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、離心機(jī)2）為反應(yīng)預(yù)混液標(biāo)記一個適當(dāng)大小的反應(yīng)管：ReactionMix。3）將所需劑量的每種組分添加到反應(yīng)管中：母液（2.0X）12.5pL、檢測母液（20.0X）1.3pL、水8知L，總劑量22.6pL，加上10%的超額量2.26pL，共計24.86pL，24次反應(yīng)所需劑量為596.6|iL注意：將檢測母液置于冰柜中避光儲存，直到準(zhǔn)備使用。過多暴露在光線下會影響熒光探針。計算中包括額外劑量，以便為試劑轉(zhuǎn)移期間發(fā)生的損失提供多余劑量。建議至少準(zhǔn)備10%的超額量。4）用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上反應(yīng)管蓋。5）短暫地離心反應(yīng)管以除去氣泡。6）將反應(yīng)預(yù)混液置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。注意：使用之前，請執(zhí)行以下操作：-搖晃瓶子，徹底混合母液。-振蕩反應(yīng)管以重新懸浮檢測母液，然后短暫地離心反應(yīng)管。-將任何冷凍樣本置于冰上將其解凍。解凍時，進(jìn)行振蕩以重新懸浮樣本，然后短暫地離心反應(yīng)管。4、準(zhǔn)備反應(yīng)板為每個重復(fù)組準(zhǔn)備反應(yīng)物，然后將它們轉(zhuǎn)移到反應(yīng)板。采用StepOne軟件中顯示的反應(yīng)板布局。1）所需材料反應(yīng)預(yù)混液ReactionMix、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、水MicroAmpTMFastOptical48-WellReactionPlateMicroAmpTMOptical48-WellAdhesiveFilm微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、離心機(jī)2）準(zhǔn)備靶陰性對照反應(yīng)預(yù)混液：*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07a.向一個適當(dāng)大小的反應(yīng)管中，加入下面所列劑量的反應(yīng)預(yù)混液和水。反應(yīng)管反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量（嘰）水量（嘰）1Reactionmix74.68.3用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上反應(yīng)管蓋。短暫地離心反應(yīng)管以除去氣泡。向反應(yīng)板的相應(yīng)反應(yīng)孔中分別加入25pL的陰性對照反應(yīng)預(yù)混液。3）對于每個重復(fù)組，準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液：向適當(dāng)大小的反應(yīng)管中，加入下面所列劑量的反應(yīng)預(yù)混液和標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)管標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量（^L）標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品劑量（pL）1Std1Reactionmix74.6Std18.32Std2Reactionmix74.6Std28.33Std3Reactionmix74.6Std38.34Std4Reactionmix74.6Std48.35Std5Reactionmix74.6Std58.3用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上各反應(yīng)管蓋。短暫地離心各反應(yīng)管以除去氣泡。向反應(yīng)板的相應(yīng)反應(yīng)孔中加入25|iL的標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液。4）對于每個重復(fù)組，準(zhǔn)備未知樣本的反應(yīng)預(yù)混液：a.向適當(dāng)大小的反應(yīng)管中，加入下面所列劑量的反應(yīng)預(yù)混液和樣本。反應(yīng)管未知樣本反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量（嘰）樣本樣本劑量（嘰）1poplReactionmix74.6pop18.32Pop2Reactionmix74.6Pop28.3b.用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上各反應(yīng)管蓋。短暫地離心各反應(yīng)管以除去氣泡。向反應(yīng)板的相應(yīng)反應(yīng)孔中加入25pL的未知（樣本）反應(yīng)預(yù)混液。5）用孔板高透光度蓋膜密封反應(yīng)板。6）短暫地離心反應(yīng)板以除去氣泡。7）在您準(zhǔn)備好運(yùn)行實(shí)驗(yàn)之前，將反應(yīng)板置于陰暗處的冰上。注意：當(dāng)您準(zhǔn)備自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)時：確保您使用適當(dāng)?shù)暮牟摹?歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07?確保PCR反應(yīng)的安排與StepOne軟件中顯示的反應(yīng)板布局一致。您可以：-接受軟件自動生成的反應(yīng)板布局?；?使用AdvancedSetup（高級設(shè)置）工作流程更改軟件中的反應(yīng)板布局。三、運(yùn)行試驗(yàn)1、準(zhǔn)備運(yùn)行打開實(shí)驗(yàn)并將密封的MicroAmpTMFastOptical48-WellReactionPlate裝載到StepOneTM擴(kuò)增儀以準(zhǔn)備運(yùn)行。1）打開設(shè)計的實(shí)驗(yàn)打開StepOne從Home屏幕上，單擊Open在Open對話框中，導(dǎo)航到experiments文件夾（默認(rèn)）找到創(chuàng)建的試驗(yàn)設(shè)計，打開。2）裝載反應(yīng)板（帶無粉手套）a.打開擴(kuò)增儀抽屜^將反應(yīng)載體放置在樣本加熱塊中。反應(yīng)板的方向取決于您所用耗材的類型：?若使用一個反應(yīng)板，讓A1反應(yīng)孔位于樣本加熱塊的左后角。?若使用反應(yīng)管條帶，則將條帶置于樣本加熱塊中。小心地關(guān)閉擴(kuò)增儀抽屜。2、啟動運(yùn)行若計算機(jī)已通過StepOne系統(tǒng)線纜直接連接到StepOne擴(kuò)增儀，則執(zhí)行下列步驟。（并置啟動）1）在StepOne軟件中，單擊TemperaturePlot（溫度曲線）。2）單擊STARTRUN（啟動運(yùn)行）。3、監(jiān)視運(yùn)行1）并置監(jiān)視運(yùn)行期間，定期查看StepOne軟件提供的所有三條曲線是否存在潛在問題。停止運(yùn)行在StepOne軟件中，單擊STOPRUN（停止運(yùn)行）。對話框中包括：-StopImmediately（立即停止）以立即停止運(yùn)行。-StopafterCurrentCycle/Hold（當(dāng)前循環(huán)/保持階段后停止）以在當(dāng)前循環(huán)或保持階段之后停止運(yùn)行。-Cancel（取消）以繼續(xù)運(yùn)行。實(shí)時查看擴(kuò)增數(shù)據(jù)AmplificationPlot（擴(kuò)增曲線）屏幕允許在StepOne擴(kuò)增儀運(yùn)行期間采集熒光數(shù)據(jù)時查看樣本擴(kuò)增。若設(shè)置了某種方法以采集實(shí)時數(shù)據(jù)，AmplificationPlot（擴(kuò)增曲線）屏幕上會顯示在ViewPlateLayout（查看反應(yīng)板布局）選項(xiàng)卡中所選反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)。擴(kuò)增曲線將對照歸一化染料熒光（ARn）循環(huán)數(shù)。*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07AmplificationPlot（擴(kuò)增曲線）屏幕對識別和檢查異常擴(kuò)增十分有用。異常擴(kuò)增可能包括以下情況：?陰性對照反應(yīng)孔中熒光增強(qiáng)。?預(yù)期循環(huán)中不存在可檢測熒光（在相同情況下使用相同試劑從先前類似的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行確定）。實(shí)時查看運(yùn)行的溫度數(shù)據(jù)。運(yùn)行期間，TemperaturePlot（溫度曲線）屏幕上實(shí)時顯示樣本加熱塊、受熱護(hù)蓋門和樣本（已計算）的溫度。TemperaturePlot（溫度曲線）屏幕對識別硬件故障十分有用。當(dāng)監(jiān)視TemperaturePlot（溫度曲線）屏幕時，觀察Sample（樣本）、HeatedCover（受熱護(hù)蓋門）和SampleBlock（樣本加熱塊）曲線是否出現(xiàn)異常情況。?通常，Sample（樣本）和Block（樣本加熱塊）曲線應(yīng)大約相互對應(yīng)。兩條曲線存在顯著偏差可能表示存在問題。?HeatedCover（受熱護(hù)蓋門）曲線應(yīng)保持方法中指定的常溫。偏離一致溫度可能表示存在問題。在RunMethod（運(yùn)行方法）屏幕上查看運(yùn)行進(jìn)度開始運(yùn)行之后，StepOne系統(tǒng)會在RunMethod（運(yùn)行方法）屏幕上顯示運(yùn)行進(jìn)度。例如對于方法的溫度變化過程報告運(yùn)行進(jìn)度。更改運(yùn)行方法（添加循環(huán)、保持或解鏈曲線）?在導(dǎo)航窗格中，單擊RunMethod（運(yùn)行方法）。?在RunMethod（運(yùn)行方法）屏幕上，執(zhí)行以下任意操作-輸入要應(yīng)用于CyclingStage（循環(huán)階段）的循環(huán)數(shù)。-若您想要將解鏈曲線階段添加到運(yùn)行的末尾，則選擇AddMeltCurveStagetoEnd（將解鏈曲線階段添加到末尾）。-若您想要將保持階段添加到運(yùn)行的末尾，則選擇AddHoldingStagetoEnd（將保持階段添加到末尾）。?單擊SendtoInstrument（發(fā)送到擴(kuò)增儀）啟用/禁用通知設(shè)置。取或取消選取EnableNotifications（啟用通知）復(fù)選框。2）遠(yuǎn)程監(jiān)視若將您的StepOne擴(kuò)增儀連接到網(wǎng)絡(luò)，您可使用StepOne軟件的遠(yuǎn)程監(jiān)視功能從網(wǎng)絡(luò)上的任何一臺計算機(jī)上實(shí)時查看運(yùn)行進(jìn)度。4、卸載反應(yīng)板并傳輸數(shù)據(jù)當(dāng)StepOne擴(kuò)增儀顯示RunHistory（運(yùn)行歷史）屏幕時，從StepOne擴(kuò)增儀上卸載反應(yīng)板，并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C(jī)以進(jìn)行分析。當(dāng)StepOne擴(kuò)增儀完成一次運(yùn)行時，系統(tǒng)會將運(yùn)行詳情保存到運(yùn)行歷史記錄，在擴(kuò)增儀完成另一次運(yùn)行之前，該運(yùn)行歷史記錄會保留在系統(tǒng)中。1）當(dāng)StepOne擴(kuò)增儀觸摸屏上顯示RunReport（運(yùn)行報告）屏幕時2）打開擴(kuò)增儀抽屜。3）從樣本加熱塊中取出反應(yīng)板。4）小心地關(guān)閉擴(kuò)增儀抽屜。切記！不要在運(yùn)行后關(guān)閉StepOne擴(kuò)增儀電源開關(guān)。不使用時，擴(kuò)增儀會自動進(jìn)入休眠模式。并置數(shù)據(jù)的傳輸是自動傳輸。四、實(shí)驗(yàn)分析StepOneTM軟件使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)打開StepOne，從Home屏幕上，單擊Open，在對話框中，導(dǎo)航到experiments文件夾，找到創(chuàng)建的試驗(yàn)設(shè)計，打開實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)文件，單擊Analyze（分析），軟件使用默認(rèn)分析設(shè)置來分析數(shù)據(jù)。1）軟件元素ExperimentMenu（實(shí)驗(yàn)菜單）窗格-提供到以下軟件屏幕的鏈接：Setup（設(shè)置）屏幕?Run（運(yùn)行）屏幕Analysis（分析）屏幕：-AmplificationPlot（擴(kuò)增曲線）-StandardCurve（標(biāo)準(zhǔn)曲線）-MulticomponentPlot（多組分曲線）-RawDataPlot（原始數(shù)據(jù)曲線）-QCSummary（QC摘要）-MultiplePlotsView（多曲線視圖）Plot（曲線）窗格-為已打開的實(shí)驗(yàn)顯示所選分析屏幕。View（視圖）選項(xiàng)卡-為已打開的實(shí)驗(yàn)顯示反應(yīng)板布局或反應(yīng)孔表Experiment（實(shí)驗(yàn)）選項(xiàng)卡-為每個打開的實(shí)驗(yàn)顯示一個選項(xiàng)卡。2）如何選擇反應(yīng)孔要在分析屏幕上顯示特定反應(yīng)孔，在ViewPlateLayout（查看反應(yīng)板布局）選項(xiàng)卡上選擇相應(yīng)的反應(yīng)孔，操作如下：要選擇某特定類型的反應(yīng)孔，使用SelectWellsWith（選擇反應(yīng)孔類型）下拉菜單：選擇Sample（樣本）、Target（靶）或Task（任務(wù)），然后選擇樣本、靶或任務(wù)名稱。要選擇單個反應(yīng)孔，在反應(yīng)板布局中單擊該反應(yīng)孔。要選擇多個反應(yīng)孔，按住CTRL鍵并單擊、或按住Shift鍵并單擊反應(yīng)板布局中的某反應(yīng)孔并拖移鼠標(biāo)覆蓋所需的反應(yīng)孔。要選擇所有48個反應(yīng)孔，單擊反應(yīng)板布局的左上角。3）如何顯示多條曲線使用MultiplePlots（多曲線）屏幕可同時顯示最多4條曲線。要在MultiplePlots（多曲線）屏幕內(nèi)導(dǎo)航：從ExperimentMenu（實(shí)驗(yàn)菜單）窗格中，選擇Analysis（分析）^MultiplePlotsView（多曲線視圖）。要顯示四條曲線，單擊：：Showplotsina2x2matrix（以2x2窗格方式顯示曲線）。要在兩行中顯示兩條曲線，單擊：Showplotsintworows（以兩行顯示曲線）。要在兩列中顯示兩條曲線，單擊??Showplotsintwocolumns（以兩列顯示曲線）。要顯示某特定曲線，從每條曲線顯示上方的下拉菜單中選擇該曲線。2、查看標(biāo)準(zhǔn)曲線StandardCurve（標(biāo)準(zhǔn)曲線）屏幕顯示指定為標(biāo)準(zhǔn)品的樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線。StepOne軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算未知靶的數(shù)量。在StandardCurve（標(biāo)準(zhǔn)曲線）屏幕上檢查以下回歸系數(shù)值：?Slope（斜率）/擴(kuò)增效率斜率/擴(kuò)增效率值-擴(kuò)增效率通過使用標(biāo)準(zhǔn)曲線中回歸線的斜率來計算。斜率接近-3.3表示最佳，即100%PCR擴(kuò)增效率。影響擴(kuò)增效率的因素包括：-標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量范圍，為了獲得更準(zhǔn)確及更精確的效率測量值，使用大范圍的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量（5至6個對數(shù)級（105至106倍）。-標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)數(shù)，為了獲得更準(zhǔn)確的效率測量值，包括重復(fù)數(shù)以降低移液誤差的影響。-PCR抑制劑-反應(yīng)中的PCR抑制劑可降低擴(kuò)增效率。*歐陽光明*創(chuàng)編?R2值（相關(guān)系數(shù)）R2值表示標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸線與標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)的單個CT數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的擬合程度。值1.00表示回歸線與數(shù)據(jù)點(diǎn)完全擬合。R2值＞0.99較理想。?CT值閾值循環(huán)（CT）是熒光水平達(dá)到閾值時的PCR循環(huán)數(shù)。CT值＞8且＜35較理想。CT值＜8表明反應(yīng)中有太多模板。CT值＞35表明反應(yīng)中靶的數(shù)量太少；對于CT值＞35的情況，期望更高的標(biāo)準(zhǔn)偏差。1）從ExperimentMenu（實(shí)驗(yàn)菜單）窗格中，選擇Analysis（分析）StandardCurve（標(biāo)準(zhǔn)曲線）。注意：如果StandardCurve（標(biāo)準(zhǔn)曲線）屏幕中未顯示數(shù)據(jù)，單擊Analyze（分析）。2）在ViewPlateLayout（查看反應(yīng)板布局）選項(xiàng)卡上單擊反應(yīng)板布局的左上角，以在StandardCurve（標(biāo)準(zhǔn)曲線）屏幕上顯示全部48個反應(yīng)孔。3）從Target（靶）下拉菜單中，選擇All（全部）。4）從PlotColor（曲線顏色）下拉菜單中，選擇Default（默認(rèn)）。5）單擊Show/Hidetheplotlegend（顯示/隱藏曲線圖例）。6）查看標(biāo)準(zhǔn)曲線下面顯示的值。在示例實(shí)驗(yàn)中，靶（RNaseP）的值在可接受范圍之內(nèi)：*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07—斜率為-3.464。-R2值為1。-擴(kuò)增效率（Eff%）為94.376%。7）檢查所有樣本均在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)。在示例實(shí)驗(yàn)中，所有樣本（藍(lán)點(diǎn)）均在標(biāo)準(zhǔn)曲線（紅點(diǎn)）內(nèi)。8）檢查CT值：單擊ViewWellTable（查看反應(yīng)孔表）選項(xiàng)卡。從GroupBy（分類方式）下拉菜單中，選擇Replicate（重復(fù)）。查看CT列中的值。在示例實(shí)驗(yàn)中，CT值在預(yù)期范圍（＞8且＜35）內(nèi)。3、查看擴(kuò)增曲線①AmplificationPlot（擴(kuò)增曲線）屏幕上顯示所選反應(yīng)孔內(nèi)所有樣本的擴(kuò)增情況。有三種曲線可供選擇：ARn隨循環(huán)變化-ARn是PCR運(yùn)行生成的歸一化熒光信號的量值，且是計算CT所依據(jù)的數(shù)據(jù)。此曲線將ARn作為循環(huán)數(shù)的一個函數(shù)顯示。您可通過此曲線來識別并檢查不規(guī)則擴(kuò)增，并查看運(yùn)行的閾值和基線值。Rn隨循環(huán)變化-Rn是歸一化報告熒光染料。此曲線將Rn作為循環(huán)數(shù)的一個函數(shù)顯示。您可通過此圖來識別和檢查不規(guī)則擴(kuò)*歐陽光明*創(chuàng)編2021.03.07?CT隨反應(yīng)孔變化-閾值循環(huán)（CT）是熒光水平達(dá)到閾值時的PCR循環(huán)數(shù)。此曲線將閾值循