外泌體的載藥方法和給藥途徑

———外泌體的載藥方法和給藥途徑

藥物傳遞系統(tǒng)DDS：是將脂質(zhì)體、微囊、微球、微乳、納米囊、納米球、外泌體等作為藥物載體將藥物通過不同的給藥方式，直接輸送到病灶部位的一種新型醫(yī)療方式。

將藥物加載到外泌體

在進(jìn)行藥物傳遞系統(tǒng)DDS設(shè)計時，其中一個重要的環(huán)節(jié)就是載藥方法。由于外泌體具有生物相容性、穩(wěn)定性和腫瘤靶向性，隨著外泌體技術(shù)研究的不斷發(fā)展使它們成為有前景的藥物載體。外泌體的構(gòu)建類似于雙膜脂質(zhì)體，并且藥物裝載方法也類似。但在藥物傳遞系統(tǒng)DDS設(shè)計前需要根據(jù)藥物和外泌體特性仔細(xì)選擇。

外泌體可以通過被動或主動方法裝載多種藥物、大分子和其他物質(zhì)（圖3）。被動方法比較簡單，它是基于藥物與外泌體或細(xì)胞孵育，并進(jìn)一步分離含有藥物的釋放外泌體（圖3I、II）。這種方法通過不同的藥物濃度梯度來實現(xiàn)；因此，在與外泌體孵育期間，物質(zhì)本身也會遷移到囊泡中。這一過程可以通過施加額外的力來加強(qiáng)，例如搖動或攪拌等.

被動裝載法的缺點是裝載效率低，輸出藥物濃度低（約1%）。將藥物與外泌體或其他DDS載體一起孵育是一種較常見并且簡單的方法，尤其適用于疏水性藥物。

主動加載方法可以實現(xiàn)更高的加載效率，包括超聲處理(可達(dá)~28%)、電穿孔(~5%)、擠壓、凍融、pH梯度(1.7%)和結(jié)合方法。具體方法是通過超聲處理和電穿孔在外泌體膜上穿孔，再分別由聲波或電脈沖介導(dǎo)（圖3III、IV）。之后，外泌體將通過上述試劑誘導(dǎo)的小膜孔從溶液中加載藥物。這些方法似乎不會改變外泌體膜的特性，但會導(dǎo)致外泌體大小增加。

主動加載法的另一種方法是通過抗體或點擊化學(xué)將藥物與外泌體結(jié)合?？贵w將通過它們對外泌體結(jié)構(gòu)元素的親和力非共價結(jié)合到外泌體表面（圖3七).化學(xué)合成將導(dǎo)致藥物通過例如PEG或膜蛋白與外泌體共價結(jié)合，并且進(jìn)一步釋放取決于外泌體降解。這些方法還可以通過將特定受體引入膜來將外泌體靶向所需細(xì)胞。圖3.將藥物裝入外泌體的方法。

(I)從藥物暴露細(xì)胞中釋放的載藥外泌體，

(II)藥物與外泌體孵育并攪拌，

(III)超聲處理，

(IV)電穿孔，

(V)擠出，

(VI)凍融循環(huán)，

(VII)-藥物與外泌體的化學(xué)綴合。以上步驟中提到的方法允許根據(jù)藥物的親水性和親脂性將藥物摻入外泌體或磷脂雙層的內(nèi)部。親水性物質(zhì)將滲透于外泌體的腔內(nèi)，而可溶于脂質(zhì)的物質(zhì)將聚集在外泌體的膜上（圖2）。一些研究報告證明，親水性物質(zhì)很容易加載到外泌體中，而親脂性物質(zhì)的加載效率較低。通常，這些物質(zhì)在體外24小時內(nèi)從外泌體釋放約50%。

選擇藥物加載方法時需要考慮到對外泌體結(jié)構(gòu)和特性的影響。目前，通過電穿孔的聚集和融合法使用較為普遍。

實際上，外泌體作為細(xì)胞間信號傳遞分子可以遞送多種物質(zhì)，包括化療藥物（紫杉醇、多柔比星和紫杉醇）、RNA和DNA等。另外，近年來還針對細(xì)菌（弓形蟲病和沙門氏菌?。?、病毒（艾滋病和乙型肝炎）、癌癥（肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、腦癌和乳腺癌）等進(jìn)行基于外泌體的疫苗開發(fā)設(shè)計。所以外泌體也常被用作基因編輯工具遞送的工具，例如Cas9.

給藥途徑

根據(jù)目前的研究，外泌體主要通過靜脈內(nèi)給藥，位置主要為肝臟肺和腦、胃中，只有少數(shù)研究使用另一種給藥方法，即經(jīng)鼻、口服和腹膜內(nèi)給藥。

表4.外泌體的藥物、大分子和潛在靶向策略示例。外泌體的藥物方法和給藥途徑藥物/大分子加載效率和方法起源靶向細(xì)胞/組織影響紫杉醇1.4%；逆轉(zhuǎn)錄孵育；5.3%；電穿孔；28.3%；輕度超聲處理RAW264.7細(xì)胞系MadinDarby犬腎MDCKWT和MDCKMDR1細(xì)胞，小鼠Lewis肺癌細(xì)胞亞系(3LL-M27)多重耐藥細(xì)胞系的細(xì)胞毒性增加超過50倍。阿霉素7.4%；超聲處理和隨后的擠壓4T1細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞系近紅外激光觸發(fā)的多柔比星從用Fe3O4修飾的外泌體中釋放。阿霉素6.5%；超聲處理雄性KM小鼠的小鼠骨髓斑馬魚，攜帶C6-Luc神經(jīng)膠質(zhì)瘤的小鼠快速血腦屏障穿越和腦積聚。靶向：浸潤性腦腫瘤細(xì)胞。hsa-miR148a-3p無損檢測；化學(xué)轉(zhuǎn)染（Lipofectamine2000）牛奶HepG2、Caco-2細(xì)胞系具有成本效益的外泌體來源。時間依賴性細(xì)胞摻入。紫杉醇8%；逆轉(zhuǎn)錄孵育牛奶裸鼠肺腫瘤異種移植腫瘤生長抑制。與靜脈內(nèi)給藥相比，全身和免疫原性毒性較低紫杉醇14%；藥物孵育細(xì)胞來自臍帶的MSCA549、SK-OV-3、MDA-hyb1細(xì)胞系；NODscid小鼠的MDA-hyb1乳腺腫瘤與含有紫杉醇的外泌體相比，使用高1000倍濃度的游離紫杉醇可減少癌癥的生長和轉(zhuǎn)移。埃拉斯汀3.2毫克erastin/毫克蛋白質(zhì)；超聲處理HFL-1細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞系用于靶向遞送、促進(jìn)鐵死亡、減少增殖和癌細(xì)胞遷移的葉酸標(biāo)記外泌體。CRISPR/Cas9質(zhì)粒DNA來自MSC的外泌體的化學(xué)轉(zhuǎn)染（Exo-Fect外泌體轉(zhuǎn)染試劑盒）；KPC689成功破壞胰腺癌細(xì)胞中的KrasG12D致癌等位基因。抑制增殖和腫瘤生長CRISPR/Cas9質(zhì)粒DNA細(xì)胞(HEK293T)的化學(xué)轉(zhuǎn)染(Lipofectamine2000)和從條件培養(yǎng)基中分離外泌體HEK293T細(xì)胞系細(xì)胞系PEI基質(zhì)中靶向KRAS的siRNA；90%；與PEI基質(zhì)孵育；牛初乳H1299、A549、H522、Panc-1、MiaPaCa-2細(xì)胞系；體內(nèi)A549異種移植模型抑制腫瘤生長和KRAS表達(dá)。在p53-nullH1299細(xì)胞中誘導(dǎo)p53的表達(dá)。編碼p53的質(zhì)粒DNA5%；電穿孔；35%用Exo-Fect進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)染（約35%）阿霉素;膽固醇修飾的miRNA15974.5160.6ng/g外泌體；在三乙胺溶液中孵育；1.2%的miRNA，5.3%的膽固醇修飾的miRNATHP-1細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞系外泌體的靶向特性，對癌細(xì)胞的協(xié)同治療作用，抑制生長和運動。TCF-7基因的沉默。5-氟尿嘧啶；miR-21抑制劑寡核苷酸3.1%；0.5%；電穿孔293T細(xì)胞系HCT-116SFR細(xì)胞系；體內(nèi)BALB/c裸鼠成功共遞送、細(xì)胞中miR-21的下調(diào)、周期停滯的誘導(dǎo)、增殖減少、耐藥性逆轉(zhuǎn)、5-FU細(xì)胞毒性增加、體內(nèi)腫瘤生長減少miR-31-5p不適用；電穿孔牛奶HUVEC細(xì)胞系；體內(nèi)BALB/c小鼠體外細(xì)胞功能改善，血管生成增強(qiáng)，糖尿病小鼠體內(nèi)傷口愈合CD47和SIRP抗體通過pH敏感接頭與外泌體表面綴合RAW264.7細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞系，體內(nèi)BALB/C小鼠靶向CD47表達(dá)細(xì)胞，改善巨噬細(xì)胞吞噬作用，外泌體重編程巨噬細(xì)胞抗癌活性galectin-9siRNA，奧沙利鉑半乳糖凝集素9、13.17%馬來酰亞胺-硫醇偶聯(lián)物的13.17%N/A電穿孔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞PANC-02細(xì)胞系，體內(nèi)C57BL/6小鼠，SD大鼠顯著的抗癌活性，提高巨噬細(xì)胞腫瘤抑制活性，增加細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的募集小檗堿17.13%，超聲處理原代巨噬細(xì)胞C57BL/6J小鼠巨噬細(xì)胞抗炎和抗凋亡M2表型的誘導(dǎo)，脊髓損傷后小鼠運動的改善Erastin、RoseBengal、CD47表面標(biāo)記的外泌體60%、84%的包封率，超聲處理；CD47質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞HEK293T細(xì)胞系RAW264.7Hepa1-6細(xì)胞系，體內(nèi)C57BL/6阻止外泌體吞噬作用，激光照射后體內(nèi)和體外鐵死亡誘導(dǎo)，外泌體肝腎細(xì)胞毒性降低miR-138-5p慢病毒轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞脂肪來源的干細(xì)胞T24，5637細(xì)胞系，體內(nèi)BALB/C裸鼠膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲減少，抑制體內(nèi)腫瘤生長

近些年，外泌體研究領(lǐng)域發(fā)展迅速，來新型外泌體分離技術(shù)實現(xiàn)了從小體積樣品中快速、高效、精確地分離，在外泌體研究也取得了許多重大進(jìn)展，這些都使外泌體成為納米藥物、基因要等創(chuàng)新藥的遞送工具。外泌體技術(shù)的發(fā)展對于未來的外泌體的檢測、生物標(biāo)志物篩選以及癌癥的鑒別等也都具有重要的意義。選擇外泌體作為給藥載體的主要優(yōu)勢在于它可以降低藥物濃度，能夠準(zhǔn)確到病灶部位有效提高效率并減少藥物的毒副作用。盡管如此，外泌體的載藥效率仍有提升空間。比如：在外泌體研究領(lǐng)域中，由于不同供體細(xì)胞分離的外泌體特性也是不同的，需要足夠了解與熟悉各種外泌體