DNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和重組子的篩選與鑒定

/山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2013年m月22日至11月19日涔姓名—系年級2011級生技一班學(xué)號201100140112組別_四題目DNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和重組子的篩選與鑒定同組者一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的分類、特性與作用原理。掌握對DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。學(xué)習(xí)和掌握DNA連接酶的作用原理以及利用TDNA連接酶構(gòu)建重組DNA分子的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。4學(xué)習(xí)和掌握利用CaCl2制備E.coli感受態(tài)細(xì)胞的原理與方法。學(xué)習(xí)和掌握熱激法轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞的原理與方法。掌握a-互補(bǔ)篩選法的原理。學(xué)習(xí)用試劑盒提取質(zhì)粒DNA的方法。復(fù)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的原理及方法。學(xué)習(xí)和掌握利用瓊脂糖凝膠電泳篩選重組質(zhì)粒。二、【實(shí)驗(yàn)原理】通過切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶叫做核酸酶，其中特異水解斷裂RNA分子的酶被稱為核糖核酸酶，而特異性水解斷裂DNA分子的酶被稱為脫氧核糖核酸酶。核酸酶按其水解斷裂核酸分子的不同方式，分為兩種類型，一種是從核酸分子的末端開始，一個(gè)一個(gè)核苷酸地消化降解多核苷酸鏈，叫做核酸外切酶。另一種是從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔研纬尚∑?，叫做核酸?nèi)切酶。重組質(zhì)粒的構(gòu)建需要對DNA分子進(jìn)行切割，并連接到合適的載體上進(jìn)行體外重組。限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，為重組質(zhì)粒的構(gòu)建提供了有力的工具。限制性核酸內(nèi)切酶（1）限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈^入分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的酶，主要是從原核生物中分離純化出來的。根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）°I型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解，I型酶切割位點(diǎn)是隨機(jī)的，至少距識別位點(diǎn)1000bp；而II型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解，11型限制酶的切割位點(diǎn)一般在識別序列上或與之靠近，而且具有序列特異性，故在基因克隆中有特別廣泛的用途。。III型限制性內(nèi)切酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用。III型限制酶的切割位點(diǎn)距識別序列3'端為24—26bp。限制-修復(fù)系統(tǒng)：在限制性核酸內(nèi)切限制酶的作用下，侵入細(xì)菌的“外源”DNA分子便會被切割成不同大小的片段，而細(xì)菌自己固有的DNA由于修飾酶(通常是一種甲基化酶)的保護(hù)作用，則可免受限制酶的降解。限制作用的本質(zhì)是限制性核酸內(nèi)切酶的切割反應(yīng)，修飾作用的本質(zhì)是甲基化酶的甲基化作用，這兩種酶分別為宿主hsdR和hsdM基因的產(chǎn)物，它們作用時(shí)的位點(diǎn)識別需要hsdS基因產(chǎn)物的協(xié)助。II型核酸內(nèi)切限制酶具有3個(gè)基本的特性：①在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂；②2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相對的；斷裂結(jié)果形成的DNA片段往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。限制性核酸內(nèi)切酶的命名：限制性核酸內(nèi)切酶的命名普遍采用H-Smith和D-Nathaus于1973年提出的命名系統(tǒng)，根據(jù)分理出該酶的微生物的學(xué)名進(jìn)行的，通常為3個(gè)字母：第一個(gè)字母大寫，用斜體，來自微生物屬名的第一個(gè)字母；第二、第三個(gè)字母小寫，用斜體，來自微生物種名的頭兩個(gè)字母，如果該微生物有不同的變種和品系，則再加一個(gè)來自變種或品系的第一個(gè)字母，大寫還是小寫應(yīng)根據(jù)具體情況而定，但要用正體；從同一種微生物中發(fā)現(xiàn)的幾種限制酶，則根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)和分離的順序用I、II、III等羅馬數(shù)字表示，用正體。例如從E.coli(Escherichiacoli)R株中發(fā)現(xiàn)并分離的第一種限制酶被稱為EcoRI。限制性核酸內(nèi)切酶的基本特點(diǎn)位點(diǎn)特異性：絕大多數(shù)的II型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識別由4-8個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列，這些特定的序列大多呈回文結(jié)構(gòu)，我們稱這樣的序列為限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列。不過有的限制性核酸內(nèi)切酶可識別兩種以上的核苷酸序列。同裂酶和同尾酶：有一些來源不同的限制酶能識別同樣的核苷酸靶序列，這類酶特稱為同裂酶，同裂酶產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。與同裂酶對應(yīng)的一類限制性核酸內(nèi)切酶，它們來源不同，識別的靶序列也各不相同，但都產(chǎn)生相同的黏性末端，稱為同尾酶。由一對同尾酶分別產(chǎn)生的黏性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，稱之為雜種位點(diǎn)，但是這類雜種位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，一般是不能夠再被原來的任何一種同尾酶所識別的。限制性核酸內(nèi)切酶對DNA底物的酶切作用是否完全，直接關(guān)系到連接反應(yīng)、重組體分子的篩選和鑒定等實(shí)驗(yàn)結(jié)果。核酸內(nèi)切限制酶活性的充分發(fā)揮受到以下幾個(gè)因素的影響：DNA純度：在DNA樣品中若含有蛋白質(zhì)，或沒有去除干凈制備過程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高濃度金屬離子，均會降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。②核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液：核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液包括氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、Tris-HCL、巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等.使用所有限制酶均可發(fā)揮活性的一種緩沖液。不同限制性內(nèi)切酶對NaCl濃度的要求不同，這是不同限制酶緩沖液組成上的一個(gè)主要的不同。據(jù)此可分為高鹽、中鹽和低鹽緩沖液，在進(jìn)行雙酶解或多酶解時(shí)，若這些酶切割可在同種緩沖液中作用良好，則幾種酶可同時(shí)酶切；若這些酶所要求的緩沖液有所不同,可采用以下三種方法進(jìn)行消化反應(yīng):先用要求低鹽緩沖液的限制性內(nèi)切酶消化DNA,然后補(bǔ)足適量的NaCl,再用要求高鹽緩沖液的限制酶消化;先用一種酶進(jìn)行酶解，然后用乙醇沉淀酶解產(chǎn)物，再重懸于另一緩沖液中進(jìn)行第二次酶解。③酶切消化反應(yīng)的溫度：DNA消化反應(yīng)的溫度，是影響限制內(nèi)切酶活性的一個(gè)重要因素.不同的核酸內(nèi)切限制酶，具有各自的最適反應(yīng)溫度.多數(shù)限制內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度是37°C,少數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度高于或低于37C。④DNA的分子結(jié)構(gòu)：DNA分子構(gòu)型對核酸內(nèi)切限制酶的活性有很大影響,如消化超螺旋的DNA比消化線性DNA用酶量要高出許多倍.有些限制酶在消化它們自己的處于不同部位的限制位點(diǎn)，其效率也有明顯差異.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止。限制性核酸內(nèi)切酶的星號活性限制性核酸內(nèi)切酶通常有嚴(yán)格的識別特異性，能精確地識別DNA排列順序。但在某些反應(yīng)條件下，如離子強(qiáng)度降低、pH增大、輔因子(Mg2+被其他二價(jià)陽離子取代、有機(jī)溶劑污染、甘油濃度過高和限制酶過量等，酶識別順序的特異性可能發(fā)生變化，通常是特異性降低，可識別和切割額外的位點(diǎn)，這種特異性降低的內(nèi)切酶活性被稱為“星號活性”。星號活性主要是由以下一些因素引起的：①甘油濃度過高②離子強(qiáng)度不合適③二價(jià)陽離子變化④溶液pH變化⑤有機(jī)溶劑的殘留。DNA酶切體外構(gòu)建重組DNA分子，首先要了解目的基因的酶切圖譜，選用的限制性核酸內(nèi)切酶都不能在目的基因內(nèi)部有專一的識別位點(diǎn)，即當(dāng)用一種或者兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割外源供體DNA時(shí)，能夠得到完整的目的基因。其次，選擇具有相應(yīng)的單一酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒、噬菌體等載體分子作為克隆的載體。常用的酶切方法有雙酶切法和單酶切法兩種。雙酶切法：如果只在要克隆的目的DNA二端具有不同的限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，而目的基因內(nèi)部沒有相應(yīng)的識別序列，可用這二種限制性核酸內(nèi)切酶酶切，則目6的)NA可產(chǎn)生二種不同的黏性末端。選擇同樣具有這二種限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的合適載體，酶切后，同樣產(chǎn)生二個(gè)不同的黏性末端，當(dāng)構(gòu)建重組分子時(shí)，目的DNA可以一定的方向插入載體中，這樣操作效率高，也利于重組子的篩選。單酶切法：：如果目的DNA片段只能用一種限制性核酸內(nèi)切酶切割，酶切后的片段兩端產(chǎn)生相同的粘性末端或者平末端。選擇具有同樣限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的合適載體，在構(gòu)建重組分子時(shí)，除了形成正常的重組子之外，還可能會出現(xiàn)目的DNA片段以相反方向插入載體分子中，或者目的DNA串聯(lián)后再插入載體分子中，甚至出現(xiàn)載體分子自連，重新環(huán)化的現(xiàn)象，因此重組效率較低。如果沒有很好的方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子中的重組子，篩選重組子會比用雙酶切法構(gòu)建重組DNA分子的工作量大很多。單酶切法和雙酶切法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際操作時(shí)要根據(jù)具體情況來定。不同限制性內(nèi)切酶對NaCl濃度的要求不同,這是不同限制酶緩沖液組成上的一個(gè)主要的不同。據(jù)此可分為高鹽、中鹽和低鹽緩沖液，在進(jìn)行雙酶解或多酶解時(shí)，若這些酶切割可在同種緩沖液中作用良好,則幾種酶可同時(shí)酶切；若這些酶所要求的緩沖液有所不同，可采用以下三種方法進(jìn)行消化反應(yīng)：先用要求低鹽緩沖液的限制性內(nèi)切酶消化DNA,然后補(bǔ)足適量的NaCl,再用要求高鹽緩沖液的限制酶消化;先用一種酶進(jìn)行酶解，然后用乙醇沉淀酶解產(chǎn)物，再重懸于另一緩沖液中進(jìn)行第二次酶解。酶切和連接是兩個(gè)密切相關(guān)的步驟，要達(dá)到高效率的連接，必須酶切完全，酶切的DNA數(shù)量要適當(dāng)。另外，酶切反應(yīng)的規(guī)模也取決于需要酶切的DNA的數(shù)量，以及相應(yīng)的酶量。一般的，酶切0.2-1.0ug的DNA分子時(shí)，反應(yīng)體積約為15-20ul，DNA的量增大，反應(yīng)體積可按比例適當(dāng)放大。酶的用量參考標(biāo)準(zhǔn)：一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位酶能在指定的緩沖液系統(tǒng)和溫度下，1h完全酶解1ugpBR322DNA。如果酶活力低，可以適當(dāng)增加酶的用量，但是最高不能超過反應(yīng)總體積的10%，因?yàn)橄拗菩院怂醿?nèi)切酶一般是保存在50%甘油的緩沖液中，如果酶切反應(yīng)體系中甘油的含量超過5%，將會抑制酶的活性。DNA連接(1)DNA連接酶能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3'羥基末端與5'磷酸基團(tuán)末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前用于連接DNA片段的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。E.coliDNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，不能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接°T4DNA連接酶既可用于雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接，但平末端之間連接的效率比較低。DNA連接酶同限制性核酸內(nèi)切酶一樣，都是在體外構(gòu)建重組DNA分子所必不可少的基本工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶可以將DNA分子切割成不同大小的片段，然而要將不同來源的DNA片段組成新的雜交DNA分子，還必須將它們彼此連接起來。目前有3種體外連接DNA片段的方法：①用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段；②用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNApoly（dA）-poly（dT）尾之后，再用DNA連接酶連接起來；③先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成黏性末端，再用DNA連接酶連接起來。這3種方法雖然互有差異，但共同的一點(diǎn)都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。（2）連接反應(yīng)外源DNA片段與載體分子的連接，即DNA分子體外重組，主要依賴于DNA連接酶來完成。DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的DNA連接酶是來自丁4噬菌體的DNA連接酶：T4DNA連接酶，該酶需要ATP作為輔助因子。目的DNA片段與載體DNA片段之間的連接方式主要有以下幾種：互補(bǔ)粘性末端片段之間的連接當(dāng)載體和外源DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割時(shí)，產(chǎn)生相同的粘性末端，連接后仍保留原限制性內(nèi)切酶的識別序列；如果用兩種能夠產(chǎn)生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割時(shí)，雖然可以有效地進(jìn)行連接，但是獲得的重組DNA分子消失了原來用于切割的那兩種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，這樣不利于從重組子上完整地將插入片段重新切割下來。定向克?。焊鶕?jù)核酸內(nèi)切限制酶的性質(zhì)，用兩種不同的限制酶同時(shí)消化一種特定的DNA分子，將會產(chǎn)生出具有兩種不同粘性末端的DNA片段。十分明顯，如果載體分子和待克隆的DNA分子都是用同一對核酸內(nèi)切酶切割，然后混合起來，那么載體分子和外源DNA片段將按一種取向退火形成重組DNA分子?；パa(bǔ)粘性末端連接方案中還有一個(gè)問題：片段的多拷貝插入。當(dāng)需要表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物時(shí)，多拷貝的插入，在沒有拼連剪切信號的情況下，將會導(dǎo)致表達(dá)困難或紊亂。所以需要用內(nèi)切酶圖譜對單拷貝插入片段進(jìn)行鑒定和篩選。適當(dāng)?shù)牟迦肫闻c載體分子比率能減少多拷貝插入片段的形成，一般比例為2:1（插入片段摩爾數(shù):載體摩爾數(shù)）。平末端及非互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接載體分子和外源DNA插入片段并不一定總能產(chǎn)生出互補(bǔ)的粘性末端。實(shí)際上有許多情況都是例外的，因?yàn)橛行┫拗泼盖懈頓NA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的實(shí)驗(yàn)要用兩種不同的限制酶分別切割載體分子和外源DNA，形成的也多半是非互補(bǔ)的粘性末端或平末端；再如用機(jī)械切割法制備的DNA片段，PCR擴(kuò)增的和化學(xué)合成的DNA片段或由RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA片段，也不會具有互補(bǔ)的粘性末端。既然在一定反應(yīng)條件下，用T4DNA連接酶可以將平末端的DNA片段有效地連接起來，那么對于上面提到的非互補(bǔ)粘性末端的兩種DNA片段之間，經(jīng)過專門作用于單鏈DNA的S1核酸酶處理變成平末端或用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段填補(bǔ)后變成平末端，一樣也可以使用T4DNA連接酶進(jìn)行有效地連接。不過，平末端DNA片段間的連接作用不僅在效率上明顯地低于粘性末端間的連接作用，而且重組之后一般不能從原位刪除下來。（3）連接反應(yīng)的體系的反應(yīng)條件連接酶：從理論上講，酶濃度高，催化的反應(yīng)速度快，產(chǎn)量也高。但是酶是保存在50%的甘油中的，添加過多的酶，會使連接反應(yīng)體系甘油含量過多而影響連接的效率。底物濃度:一般采用提高載體DNA和外源DNA的濃度來提高重組效率，但是底物濃度過高，連接效果也會受影響，而且載體DNA自連的概率和外源DNA多拷貝插入的概率也會提高。將載體DNA和外源DNA的摩爾數(shù)之比控制在1:（1-3）之間可以有效地解決外源DNA多拷貝插入的現(xiàn)象。緩沖液：商品連接酶都配有現(xiàn)成的連接酶反應(yīng)的緩沖液，Mg2+ATP等為輔助因子，其中ATP提供能量；DTT為酶的活性穩(wěn)定劑；BSA用于維持蛋白濃度，防止酶的變性失活。反應(yīng)條件：連接反應(yīng)所用的連接酶的最適反應(yīng)溫度是37oC，但是在這個(gè)溫度下，黏性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的，一般中間四個(gè)互補(bǔ)堿基對的結(jié)合不足以抵抗該溫度下的分子熱運(yùn)動。因此實(shí)際操作過程中，黏性末端DNA分子之間連接反應(yīng)采用介于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間的溫度，一般為16oC，平末端適當(dāng)提高連接反應(yīng)溫度，一般選擇20-25oC較為合適。反應(yīng)時(shí)間與溫度有關(guān)，隨溫度的提高，反應(yīng)速率增加，所需時(shí)間會相應(yīng)減少，16oC下最常用的連接時(shí)間為12-16h。轉(zhuǎn)化體外連接的DNA重組分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能大量地進(jìn)行復(fù)制、增殖和表達(dá)，將外源重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑，包括轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射和電穿孔等多種不同的方式。重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱之為轉(zhuǎn)化（transformation）。細(xì)菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細(xì)胞中通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應(yīng)遺傳性狀的過程。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難，尤其是那些與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的DNA分子更是如此。通常的做法是采用人工的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，熱擊法和電穿孔法是常用的人工轉(zhuǎn)化的方法熱擊法：CaCl2誘導(dǎo)的大腸桿菌制備感受態(tài)細(xì)胞，CaCl2誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化的原理是將處于對數(shù)生長期的細(xì)菌置于0°C,CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形，同時(shí)鈣離子使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài)。此時(shí)加ADNA，鈣離子又與DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸酶（Dnase）的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上。42C熱擊處理90S，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在不含抗生素的培養(yǎng)基中至少培養(yǎng)1h,使受損傷的細(xì)胞復(fù)蘇，轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生足夠的抗性蛋白，便于在含有抗生素的平板上長出抗性菌落。電穿孔法：對制備好的感受態(tài)細(xì)胞，在電場作用下，細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞，使外源）NA分子直接通過微孔，進(jìn)入細(xì)胞。近補(bǔ)篩選法利用8-半乳糖苷酶篩選系統(tǒng)，跟據(jù)菌落顏色篩選含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。載體上插入了8-半乳糖苷酶的調(diào)控序列和8-半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸的編碼序列，而其對應(yīng)的宿主菌染色體上整合有8-半乳糖苷酶C端序列的遺傳信息。當(dāng)質(zhì)粒載體導(dǎo)入相應(yīng)宿主菌后，通過a互補(bǔ)作用，形成完整的8-半乳糖苷酶。在加有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基平板上，不含質(zhì)粒pUC19的E.coliDH5a無法生長；含有質(zhì)粒pUC19的E.coliDH5a利用8-半乳糖苷酶分解培養(yǎng)基中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸，pH降低，培養(yǎng)基中的指示劑變紅，菌落變?yōu)榧t色；含有重組質(zhì)粒的E.coliDH5a具有氨芐青霉素抗性可以生長，但質(zhì)BpUC19中有外源基因插入到多克隆位點(diǎn)，使8-半乳糖苷酶N端的基因不能表達(dá)，無法實(shí)現(xiàn)a互補(bǔ)作用，所以其菌落為白色。轉(zhuǎn)化子的篩選與驗(yàn)證重組質(zhì)粒是外源基因通過單酶切（或雙酶切）與用相同的（或二種）限制性核酸內(nèi)切酶切割的質(zhì)粒載體理解后獲得的，因此在連接處仍保留原限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，用該酶（或二種酶）再次切割重組質(zhì)粒，能把插入片段切離載體，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見有載體片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片段的大小。三、【實(shí)驗(yàn)試劑與器材】菌株：E.coliDH5a培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基試劑材料：氨芐青霉素、酶切Buffer、HindIII、ddH2O.連接buffer.T4DNA連接酶、0.1MCaCl2、OMEGA公司的質(zhì)粒提取試劑盒（含有RnaseA的溶液I，溶液II，溶液I，HBbuffer,DNAwashingbuffer，Elutionbuffer）、瓊脂糖，TAE緩沖液、上樣緩沖液，EB染液儀器器材：20、200、1000ul的槍和槍尖，1.5ml的Ep管，恒溫培養(yǎng)箱，水浴鍋，培養(yǎng)皿，三角瓶，試管，接種環(huán)，牙簽，酒精燈，火柴，冰箱，離心機(jī)，電泳儀四、【實(shí)驗(yàn)步驟】準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備10ul、200ul、1ml槍尖各一盒滅菌，1.5ml離心管若干于500ml三角瓶中滅菌，牙簽若干滅菌，無菌水，配制LB液體培養(yǎng)基，分裝至100ml三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，滅菌；配制1.2%瓊脂的LB固體培養(yǎng)基150ml于300ml的三角瓶中。另配麥康凱培養(yǎng)基250ml于500ml的三角瓶中，滅菌；準(zhǔn)備3-4支試管，滅菌；培養(yǎng)皿18個(gè)；酶切及酶切產(chǎn)物的驗(yàn)證（1）酶切在冰上按照表一依次把ddH2O、10XMbuffer、DNA、HindIII加入到1.5ml無菌Ep管中。每管樣品混合均勻后，4000rpm離心1min，將液體集中于管底。將反應(yīng)體系放在37oC水浴鍋中1-2h。表一限制性內(nèi)切酶反應(yīng)體系加樣順序反應(yīng)體系成分IIIIIIpUC19（各組）久DNA（商品）pUC19（商品）1ddHO/ul213.070.064.0210XMbuffer/ul2.010.08.03DNA/ul4.015.04.04HindIII/ul1.05.04.0總體積/ul20.0100.080.0備注各組一份全班一份全班一份（2）酶切產(chǎn)物的驗(yàn)證-酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳配制緩沖液：將50XTAE稀釋至1XTAE緩沖液制膠：稱取0.4g瓊脂糖于300ml三角燒瓶中，加40皿11XTAE制成1%瓊脂糖凝膠。微波爐加熱至瓊脂糖完全溶化，待冷卻至60r左右，緩慢倒入架有梳子的電泳膠板中，勿產(chǎn)生氣泡，靜置冷卻30min以上。待其完全凝固，垂直向上拔出梳子，將膠連同托盤一起放入電泳槽中央，加入緩沖液，液面應(yīng)高于膠面1-2mm，準(zhǔn)備上樣。上樣：取8.0u1酶切反應(yīng)液、2.0u110Xloadingbuffer混勻，在加樣孔上方1-2mm處垂直點(diǎn)樣，同時(shí)點(diǎn)樣1.0ul10Xloadingbuffer和4.0ul入/HindIII、1.0ul10Xloadingbuffer和100ng入DNA、1.0ul10Xloadingbuffer和4.0ul入/HindIII（Test）、1.0ul10Xloadingbuffer和100ngpUC19（商品）、1.0ul10Xloadingbuffer和4.0ulpUC19（商品）/HIIIo表二酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳點(diǎn)樣順序泳道12345617加入的物質(zhì)入/HIII入DNA入/HindIII（Test）pUC19（商品）、pUC19（商品）/HindIII第一組酶切反應(yīng)液第十二組酶切反應(yīng)液樣品量4.0ul100ng4.0ul100ng4.0ul8.0ul8.0ul8.0ul10Xloadingbuffer1.0ul1.0ul1.0ul1.0ul1.0ul2.0ul2.0ul2.0ul點(diǎn)樣量5.0ul5.0ul5.0ul10.0ul10.0ul10.0ul電泳（實(shí)際時(shí)間根據(jù)電泳條帶的遷移情況判斷）。染色及觀察電泳完成后，將膠放入0.5ug/ml的EB染液中染色約10min，水洗，在凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果，攝片，剪輯，保存，分析結(jié)果。連接在冰上按照表三依次把ddH）、10xT4連接酶Buffer、pUC19/HindIII、入/HindIII、T4DNA連接酶加入到1.5ulEp管中（我們組分別做了老師提供的質(zhì)粒和自己的質(zhì)粒酶切后的連接）。將樣品混勻，然后4000rpm離心1min，將液體集中于管底。將反應(yīng)體系放入16oC水浴鍋中連接過夜。表三連接反應(yīng)體系加樣順序成分體積(〃l)1ddHO23.2210xT4連接酶Buffer1.03pUC19/HindIII1.5-2.04入/HindIII3.5-3.05T4DNA連接酶0.8總體積/ul10.0感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（1）感受態(tài)細(xì)胞的制備從LB平板上挑取新活化的E.coliDH5a單菌落于5mLLB液體培養(yǎng)基里，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。以1%的接種量將過夜培養(yǎng)的E.coliDH5a接種于新鮮的20mLLB培養(yǎng)基中，37C振蕩培養(yǎng)2—3小時(shí)后冰浴。分別取1.5mL菌液于2個(gè)無菌的1.5mL離心管中，4C，4000rpm離心5min，收集菌體。重復(fù)上述操作，使每個(gè)離心管中收集3mL培養(yǎng)液的菌體。殘留液體漩渦振蕩使菌體混勻。每支離心管中加入用冰預(yù)冷的100mmol/LCaCl2800ul，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置10min，4000rpm離心5min。棄上清液，加入100ul預(yù)冷的100mmol/LCaCl2溶液，用1ml移液槍吹吸輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置20min，即為感受態(tài)細(xì)胞。將上述2管制備的感受態(tài)細(xì)胞分裝到4個(gè)離心管中，每管50ul。（2）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化①取制備好的搖勻后的,4管感受態(tài)細(xì)胞懸液，I號加入老師提供的酶切質(zhì)粒的連接產(chǎn)物5.0ul,II號加1.0〃LpUC19（自提），III號不再加物質(zhì)，IV加入自己質(zhì)粒酶切的連接產(chǎn)物將以上各管輕輕搖勻。冰上放置10min。在42^水浴中熱擊90s,然后迅速置于冰上冷卻5min。向上述4管中分別加入900ul新鮮的無菌LB液體培養(yǎng)基，搖勻，37°C孵育1h,使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)。（3）稀釋和涂布平板取準(zhǔn)備的麥康凱培養(yǎng)基，冷卻至55-60C左右加入氨芐青霉素，另準(zhǔn)備1個(gè)不加氨芐青霉素的平板。涂布平板I號:實(shí)驗(yàn)組一（老師提供的酶切質(zhì)粒連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化）：取50ul、100ul、150ul、200ul培養(yǎng)液分別涂布含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基，每個(gè)梯度涂二個(gè)。IV號：實(shí)驗(yàn)組二（為自提質(zhì)粒酶切后連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化）：由于培養(yǎng)基不夠，所以我們組選了100ul、200ul各涂布了一個(gè)II號：轉(zhuǎn)化對照組：取50ul培養(yǎng)液涂布于含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基。III號：細(xì)胞對照組：分別取50ul受體菌液涂布含有氨芐青霉素和不含氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基。當(dāng)菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，于37C恒溫培養(yǎng)約24-26h，觀察菌落生長情況并記錄是否生長、菌落的數(shù)量、培養(yǎng)的顏色等現(xiàn)象。4.重組子的篩選與驗(yàn)證取一個(gè)含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基平板，在底部劃線分成4個(gè)區(qū)域。從實(shí)驗(yàn)組一平板上分別選取個(gè)3個(gè)單個(gè)的白色轉(zhuǎn)化子菌落，用接種環(huán)劃線轉(zhuǎn)接到上述3個(gè)區(qū)域，編號為1,2,3,實(shí)驗(yàn)組二平板上取一個(gè)單個(gè)的白色轉(zhuǎn)化子菌落，用接種環(huán)劃線轉(zhuǎn)接到上述第4個(gè)區(qū)域，編號為4，37C培養(yǎng)過夜。在劃線的1,2,3單菌落中選取2個(gè)白色菌落，用牙簽分別轉(zhuǎn)接到5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的試管中，編號為4-1,4-2。編號為從4中選取一個(gè)白色菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到到5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的試管中，編號為4-3,37C振蕩培養(yǎng)12-16h。分別取4-1和4-3菌液，用OMEGA公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。1）分別取1.5mL菌液于2個(gè)無菌的1.5mL離心管中，室溫下，10000rpm離心1min，收集細(xì)菌。2）倒棄培養(yǎng)基，重復(fù)步驟1一次。3）倒棄培養(yǎng)基，加入250ulSolutionI/RNaseA混合液，渦旋震蕩使細(xì)胞完全懸浮。4）往重懸混合液中加入250ulSolutionII，輕輕顛倒混勻4-6次，這步要避免劇烈混勻，且反應(yīng)時(shí)間不要超過5min.5）加入350ulSolutionIII，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀。6）室溫下，13000rpm離心10min.7）轉(zhuǎn)移上清液至套有2ml收集管的HiBindDNA結(jié)合柱中，室溫下，10000rpm離心1min，倒去收集管中的濾液。8）把柱子重新裝回收集管，加入500ulHBBuffer，10000rpm離心1min，棄去濾液。9）把柱子重新裝回收集管，加入700ulDNAWashBuffer，13000rpm離心1min，棄去濾液。10）棄去濾液，重復(fù)步驟9一次11）棄去濾液，把柱子重新裝回收集管，10000rpm離心2min以甩干柱子基質(zhì)。12）把柱子裝在干凈的1.5ml離心管上，加入30-50ulElutionBuffer到柱子基質(zhì)中，放置1-2min，10000rpm離心1min洗脫出DNA.13）把離心管中離心后的液體重新加到柱子基質(zhì)中，10000rpm離心1min洗脫。重組質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳1）配制緩沖液：將50XTAE稀釋至1XTAE緩沖液2）制膠：稱取0.4g瓊脂糖于300ml三角燒瓶中，加40ml1XTAE制成1%瓊脂糖凝膠。微波爐加熱至瓊脂糖完全溶化，待冷卻至60r左右，緩慢倒入架有梳子的電泳膠板中，勿產(chǎn)生氣泡，靜置冷卻30min以上。待其完全凝固，垂直向上拔出梳子，將膠連同托盤一起放入電泳槽中央，加入緩沖液，液面應(yīng)高于膠面1-2mm，準(zhǔn)備上樣。3）上樣：取2plddH2O,2pl質(zhì)粒，1plloadingbuffer混勻，在加樣孔上方1-2mm處垂直點(diǎn)樣，同時(shí)點(diǎn)樣6ul超螺旋marker，100ngpUC19。4）電泳（實(shí)際時(shí)間根據(jù)電泳條帶的遷移情況判斷）。5）染色及觀察電泳完成后，將膠放入0.5ug/ml的EB染液中染色約10min，水洗，在凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果，攝片，剪輯，保存，分析結(jié)果。五、【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表四實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟物質(zhì)量連接反應(yīng)pUC19/HindIII（ul）2.0入/HindIII（ul）3.5試劑盒提取質(zhì)粒ElutionBuffer（ul）35酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測1234567891011121314151617圖一：酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果泳道1為入/HindIII，泳道2為入DNA，泳道3為入/HindIII（Test），泳道4為pUC19（商品），泳道5為pUC19（商品）/HindIII，泳道9為我們組（四組）的酶切產(chǎn)物。分析：從泳道9中我們可以看到兩條比較亮的條帶，在兩條比較亮的條帶上面有兩條很暗很弱的條帶，應(yīng)該是未除盡的染色體DNA，兩條亮帶中靠上的一條和泳道5pUC19（商品）/HindIII的電泳圖在同一條線上，所以該條帶為我們酶切反應(yīng)預(yù)期想要得到的HindIII酶切開的質(zhì)粒，較亮的條帶下方的條帶和泳道4pUC19（商品）的電泳條帶在同一條線上，為沒有酶切開的超螺旋質(zhì)粒。圖譜下方比較寬而且較模糊的條帶應(yīng)該是提取質(zhì)粒時(shí)沒有除凈的RNA。從圖中我們可以看到?jīng)]有切開的質(zhì)粒占有很大的比例，如果用該酶切產(chǎn)物繼續(xù)下一步的連接反應(yīng)，效果不會很理想，所以我們連接反應(yīng)做了兩組，一組為老師提供的pUC19/HindIII（商品），一組為我們酶切的質(zhì)粒。

重組子篩選結(jié)果表五重組子的篩選涂布平板結(jié)果記錄\項(xiàng)目組別培養(yǎng)基涂布的轉(zhuǎn)化液的量/ul菌落特征紅色菌落數(shù)量白色菌落數(shù)量菌落總數(shù)量培養(yǎng)基顏色培養(yǎng)基pHI號：實(shí)驗(yàn)組一（用的老師提供的商品化酶切質(zhì)粒做連接）A+50菌落較大，菌落既有紅色也有白色10814122紅色6.0A+5012112133紅色A+100菌落為中等大小，菌落既有紅色也有白色26323286紅色5.5A+100\\\\\\\\\\\\\紅色A+150菌落偏小，既有紅色菌落也有白色41133444紅色5.5A+150\\紅色A+200菌落較小，既有紅色菌落也有白色無數(shù)紅色5.5A+200無數(shù)紅色

IV號：實(shí)驗(yàn)組二（用的我們自己的酶切質(zhì)粒）A+100菌落中等大小，既有紅色菌落也有白色紅色5.5A+200菌落中等大小，既有紅色菌落也有白色15816174紅色I(xiàn)I號：轉(zhuǎn)化對昭組八、、^zjlLA+50菌落較小，為紅色，表面形成菌膜\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\無數(shù)紅色I(xiàn)II號：細(xì)胞對照組A+50無菌落紅色A-50菌落全為白色，較小，連成片\\\\\\\\\\\\\\\\\\橙紅色7.0分析：質(zhì)粒PUC19攜帶有氨芐青霉素抗性基因（Ampr），在含有氨芐青霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化子，沒有導(dǎo)入質(zhì)粒PUC19的受體細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的平板上不生長，所以長出的菌落都是轉(zhuǎn)化子，質(zhì)粒PUC19進(jìn)入E.coliDH5a后，通過a-互補(bǔ)作用，形成完整的［3-半乳糖苷酶。在麥康凱培養(yǎng)基平板上，轉(zhuǎn)化子利用8-半乳糖苷酶分解培養(yǎng)基中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸，pH降低，培養(yǎng)集中的指示劑變紅，轉(zhuǎn)化子的菌落變紅。不含質(zhì)粒的E.coliDH5a，沒有3-半乳糖苷酶活性，不能利用培養(yǎng)集中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸，而是利用培養(yǎng)集中的有機(jī)碳源，不使培養(yǎng)基pH降低，在不含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上形成白色菌落。重組后的載體DNA因?yàn)槟康幕虻牟迦胛稽c(diǎn)在PUC19乳糖利用基因內(nèi)部，不能形成。-互補(bǔ)作用，所以也不能利用培養(yǎng)集中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸，在含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上形成白色菌落。所以實(shí)驗(yàn)組菌落既有紅色也有白色，轉(zhuǎn)化對照組菌落全為紅色，細(xì)胞對照組在含氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上不生長，在不含氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上菌落為白色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如預(yù)期所料的一樣。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄上可以明顯的看到涂有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5a的平板上，菌落數(shù)量隨加入菌液量的增多而增加，其中菌落以紅色菌落為主，零星散布有白色小菌落，根據(jù)紅白菌落的多少，計(jì)算了一下重組效率，涂布50ul轉(zhuǎn)化液的平板的重組效率為11.4%，涂布1000ul轉(zhuǎn)化液的平板的重組效率為8.7%，涂布150ul轉(zhuǎn)化液的平板的重組效率為8.0%。轉(zhuǎn)化效率是指外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的效率，通常用每微克DNA獲得轉(zhuǎn)化體的數(shù)量表示。涂布50ul轉(zhuǎn)化液的平板的轉(zhuǎn)化效率大約為1.22X105個(gè)/ugDNA,涂布100ul轉(zhuǎn)化液的平板的轉(zhuǎn)化效率大約為1.36X105個(gè)/ugDNA,涂布150ul轉(zhuǎn)化液的平板的轉(zhuǎn)化效率大約為2.12X105個(gè)/ugDNA,轉(zhuǎn)化效率較低。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對照組不加氨芐青霉素的培養(yǎng)基變?yōu)槌燃t色，其他的培養(yǎng)基仍為紅色，是因?yàn)辂溈祫P培養(yǎng)基中含有少量的中性紅，而中性紅是一種酸堿指示劑，當(dāng)溶液pH小于6.8時(shí)顯示紅色，pH大于8.0時(shí)顯示黃色。細(xì)胞對照組由于沒有轉(zhuǎn)進(jìn)質(zhì)粒，無法通過a互補(bǔ)作用分解利用乳糖，不產(chǎn)生乳酸，它是利用其他有機(jī)物質(zhì)，所以由于沒有產(chǎn)生酸，培養(yǎng)基稱弱堿性，培養(yǎng)基為橙黃色。重組子的電泳檢測12345678910111213141516圖二：重組子的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果泳道1和泳道9為超螺旋marker，泳道2為pUC19，泳道3-7和泳道10-16為1-6組的重組質(zhì)粒。分析：泳道11和泳道12為我們組（四組）的重組子的瓊脂糖凝膠電泳檢測，超螺旋marker電泳條帶自上而下的分子量對應(yīng)的是2087bp、3049bp、3997bp、5026bp、6122bp、8023bp、10085bp、11849bp，pUC19的分子量為2686bp，ADNA經(jīng)HindIII酶切后的片段大小有125bp、564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp、23130bp。泳道11為4-1實(shí)驗(yàn)組重組子，對應(yīng)超螺旋marker的條帶，該條帶在2087bp至3049bp之間，大小大約2800bp，所以該重組子是插入了125bp的片段。泳道12為4-2實(shí)驗(yàn)組重組子，對應(yīng)超螺旋marker的條帶，該條帶在8023bp至10085bp之間，大小約在9200bp，最有可能是插入了大小為6551bp的片段，也可能是同時(shí)插入了4361bp的片段和2322bp的片段，也可能是插入了4361bp的片段和2027bp的片段，也可能是插入了3個(gè)2322bp的片段，因?yàn)椴迦氲钠慰偡肿恿枯^大，所以可能情況很多，不過插入的片段不論是幾個(gè)，其總分子質(zhì)量應(yīng)該在6500bp左右。六、【注意事項(xiàng)】a.酶切限制性核酸內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)屬于微量操作技術(shù)，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性并確保樣品和酶全部加入到反應(yīng)體系中。酶切反應(yīng)中所用的Ep管，槍尖等必須是新的，經(jīng)過高溫滅菌，操作時(shí)打開使用。注意酶切加樣的順序，一般先加重蒸水，其次加緩沖液和DNA，最后加酶，加酶前先把前幾步加的物質(zhì)甩到管底，。酶液從冰箱中取出后要放在冰上，取酶液時(shí)吸頭應(yīng)從表面吸取，防止由于插入過深而使吸頭外壁沾染過多的酶液，以致影響酶的活性，取出的酶液應(yīng)立即加入反應(yīng)混合液的葉面以下，并充分混勻。酶液使用完畢后應(yīng)立即放回冰箱，防止酶的失活。Ep管的蓋子要蓋緊，防止水浴時(shí)水汽進(jìn)入管內(nèi)，并且做好標(biāo)記，防止混淆。酶切反應(yīng)結(jié)束后，裝有酶切樣品的管蓋上有大量的冷凝水，應(yīng)離心2S，使樣品集中于管底，再開蓋取樣檢測，注意防止污染。b.連接在微量操作技術(shù)、無菌技術(shù)、加樣技術(shù)等方面加以注意。C感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞必須從純種開始，要從劃線純化的單菌落開始，進(jìn)行活化培養(yǎng)，不要使用多次轉(zhuǎn)接或儲存在4<C冰箱的培養(yǎng)菌液，因?yàn)橐ＷC菌株的純度和活力?？刂萍?xì)胞的生長狀態(tài)和密度是轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵，細(xì)胞生長濃度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，細(xì)胞濃度不足或過高均會使轉(zhuǎn)化效率下降。用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)是超螺旋狀態(tài)的DNA。轉(zhuǎn)化過程要防止雜菌和其他DNA的污染，整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用的器材和試劑要經(jīng)過高溫滅菌處理，以防被微生物DNA污染。七、【實(shí)驗(yàn)討論和思考題】從電泳圖上如何判斷質(zhì)粒DNA是否單酶切完全？如果酶切完全，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖上結(jié)果只有一條條帶，且與你點(diǎn)的pUC19/HindIII電泳條帶在一條線上，完全沒有酶切的質(zhì)粒處于超螺旋狀態(tài)，因此在電泳圖上原則上只能看到超螺旋條帶，如果單酶切不完全可能出現(xiàn)超螺旋狀態(tài)和線狀質(zhì)粒條帶同時(shí)存在。感受態(tài)細(xì)胞是什么？感受態(tài)細(xì)胞是處于