現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)碩研

現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)碩研第1頁/共54頁ABC法顯示胰島B細(xì)胞ABC法顯示胰島A細(xì)胞ABC法顯示胰島D細(xì)胞H-E染色法顯示胰腺的胰島第2頁/共54頁2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述組織抗原標(biāo)記物被標(biāo)記的抗體標(biāo)記抗體與組織抗原特異性結(jié)合免疫學(xué)依據(jù)抗體抗原抗原–

抗體復(fù)合物＋特異性結(jié)合原理包括：抗原-抗體反應(yīng)、免疫標(biāo)記反應(yīng)和呈色反應(yīng)第3頁/共54頁2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）抗原-抗體反應(yīng)：抗原（antigen）：是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)，多為蛋白、多肽等分子免疫原性（immunogenicity）抗原分子具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抗原分子表面的一些特殊化學(xué)活性基團(tuán)（即表位或稱抗原決定簇）刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和/或致敏淋巴細(xì)胞反應(yīng)原性（reactogenicity）抗原分子能與抗體或致敏淋巴細(xì)胞等免疫應(yīng)答的效應(yīng)物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合完全抗原和半抗原：同時(shí)具有上述兩種能力的抗原稱為完全抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、病原微生物等；只有反應(yīng)原性而不具有免疫原性的稱為半抗原（hapten），與大分子載體結(jié)合后可獲得免疫原性，大多數(shù)多糖和類脂均屬于半抗原抗原的異物性：異種抗原、異體抗原（同種異體）、自身抗原第4頁/共54頁2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）抗原-抗體反應(yīng)：抗體（antibody）：機(jī)體在抗原刺激下，通過體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的一類能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）N端C端重鏈（H鏈）N端1/4區(qū)域內(nèi)和輕鏈（L鏈）N段1/2區(qū)域內(nèi)的氨基酸組成和順序隨免疫的抗原不同而異，稱為可變區(qū)（variableregion,V區(qū)），決定與特定抗原結(jié)合的特異性。免疫球蛋白分子V區(qū)以外的部分稱為恒定區(qū)（constantregion，C區(qū)），其氨基酸組成和順序在同一種屬動物中相對穩(wěn)定，具有相同的抗原性第5頁/共54頁抗體經(jīng)酶水解后的產(chǎn)物木瓜蛋白酶水解:：兩個(gè)相同的單抗原結(jié)合片段Fab和一個(gè)Fc片段胃蛋白酶消化：一個(gè)較大的F(ab’)2和一個(gè)Fc’片段***Fab和F(ab’)2均保留抗體活性，F(xiàn)c不能與抗原結(jié)合，但具有各類免疫球蛋白的表位和免疫原性，F(xiàn)c’繼續(xù)被胃蛋白酶水解成更小的片段，不再具有免疫原性2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）抗原-抗體反應(yīng)：抗體（antibody）第6頁/共54頁抗體的種類制備途徑不同：多克隆抗體：由于一種抗原一般具有多種表位，免疫動物后，誘導(dǎo)動物多個(gè)B細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)化為多個(gè)漿細(xì)胞克隆，產(chǎn)生識別多個(gè)不同表位的抗體，這種含有能與同一抗原多種表位結(jié)合的混合物稱多克隆抗體（polyclonalantibody）單克隆抗體：單克隆抗體（monoclonalantibody）是針對一種抗原的單個(gè)表位產(chǎn)生的抗體，由一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而來的細(xì)胞群所產(chǎn)生基因工程抗體：基因工程抗體（geneticallyengineeredantibody）是采用基因重組技術(shù)及蛋白質(zhì)工程技術(shù)，在基因及蛋白質(zhì)水平上直接切割、拼接或修飾組裝的抗體，具有特異性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更好、可批量大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)動物來源不同：兔抗體、小鼠抗體、大鼠抗體、羊抗體、驢抗體等應(yīng)用順序不同：第一抗體、第二抗體和第三抗體2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）抗原-抗體反應(yīng)：抗體（antibody）第7頁/共54頁抗體的選擇，稀釋及保存

抗體獲得：從試劑公司訂購商品化的抗體、自己制備（或通過文獻(xiàn)檢索，向相關(guān)實(shí)驗(yàn)室或作者索求）抗體的保存：從公司購買的抗體一般為凍干粉、原液或用特制稀釋液配制的即用型抗體，應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書，按照說明書的要求進(jìn)行保存和使用。長期不用的抗體可以分裝后在-80℃低溫冰箱保存，或者加入等體積的甘油，然后放入-20℃冰箱保存，可以防止結(jié)冰，有效期可長達(dá)數(shù)年。盛裝抗體的容器要有良好的密封性，并用蠟?zāi)し饪冢苑烂撍稍?。短期?nèi)頻繁使用的抗體可在4℃保存數(shù)周，無需放入低溫冰箱，以免反復(fù)凍融使抗體的效價(jià)下降，但需加入防腐劑疊氮鈉（NaN3）以防止抗體變質(zhì)。對于已稀釋過的抗體（使用特制稀釋液除外），最好在一周內(nèi)用完，不宜長期保存抗體的濃度選擇：非越濃越好（前帶效應(yīng)prozoneeffect：抗體分子過多導(dǎo)致陽性反應(yīng)減弱甚至假陰性）2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）抗原-抗體反應(yīng)：抗體（antibody）第8頁/共54頁2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（2）免疫標(biāo)記反應(yīng)：定義：用標(biāo)記物或示蹤劑將抗體標(biāo)記，以使標(biāo)記抗體與抗原發(fā)生特異性結(jié)合后能利用標(biāo)記物與其他物質(zhì)的反應(yīng)、放大并轉(zhuǎn)換為可見的有色物質(zhì)或發(fā)光物，繼而通過相應(yīng)的顯微鏡直接觀察標(biāo)記物應(yīng)具有以下特點(diǎn)：能與抗體形成牢固的共價(jià)結(jié)合不影響抗體與抗原的結(jié)合放大效率高發(fā)光或顯色反應(yīng)要在抗原-抗體結(jié)合的原位并且鮮明，有良好的對比***

常用的標(biāo)記物有熒光素、酶、親和物質(zhì)、金屬顆粒、放射性核素等***如要對組織或細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測，也可用標(biāo)記物將相應(yīng)抗原進(jìn)行標(biāo)記第9頁/共54頁2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（3）呈色反應(yīng)：定義：利用傳統(tǒng)的組織化學(xué)技術(shù)，使在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的免疫反應(yīng)復(fù)合物中的抗體上的標(biāo)記物又與其他物質(zhì)反應(yīng)，形成可見的有色沉淀，或發(fā)出熒光，最后用普通顯微鏡、電子顯微鏡或熒光顯微鏡觀察反應(yīng)產(chǎn)物或熒光3.免疫組織化學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)：抗體高度特異抗原敏感性高：最大限度保存組織或細(xì)胞內(nèi)待測物質(zhì)的抗原性、采用高敏感、高親和力的抗體和標(biāo)記復(fù)合物、多步放大免疫反應(yīng)、先進(jìn)的檢測設(shè)備形態(tài)、功能和代謝密切結(jié)合：保持了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)對組織細(xì)胞的檢測觀察客觀、仔細(xì)的優(yōu)點(diǎn)、克服了傳統(tǒng)免疫學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng)只能定性和定量，不能定位的缺點(diǎn)第10頁/共54頁4.免疫組織化學(xué)技術(shù)的分類一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）標(biāo)記物不同免疫熒光組織化學(xué)（immunofluorescencehistochemistry）：用熒光素作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體，在熒光顯微鏡下觀察抗原抗體反應(yīng)部位免疫酶組織化學(xué)（immunoenzymatichistochemistry）：用酶標(biāo)記抗體，其中酶又催化底物形成有色沉淀，在顯微鏡下觀察顯色產(chǎn)物親和免疫組織化學(xué)（affinityimmunohistochemistry）：利用某些物質(zhì)間具有高度親和力的特點(diǎn)，在免疫組織化學(xué)方法中建立有效的抗原信號放大系統(tǒng)免疫金組織化學(xué)（immunogoldhistochemistry）：用金顆粒（如膠體金）作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體，根據(jù)膠體金顆粒呈粉紅色或具有高電子密度，在光鏡或電鏡下觀察組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物第11頁/共54頁（2）根據(jù)標(biāo)記物是否與特異性第一抗體結(jié)合直接法：將特異性第一抗體用標(biāo)記物標(biāo)記，直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原結(jié)合；特異性強(qiáng)、靈敏度差***擬檢抗原種類繁多，將標(biāo)記物直接標(biāo)記在其特異性抗體上成本高，商品化可能性低間接法：對第二抗體進(jìn)行標(biāo)記，其中第一抗體可特異性結(jié)合組織或細(xì)胞中的待檢抗原，第二抗體與第一抗體的Fc段結(jié)合

***優(yōu)點(diǎn)：信息放大、提高反應(yīng)的敏感性；只要有一種動物的標(biāo)記第二抗體，便可用于該種動物的所有特異性第一抗體------間接法較直接法更為實(shí)用4.免疫組織化學(xué)技術(shù)的分類一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述第12頁/共54頁（1）取材：

準(zhǔn)確、迅速、大小合適、離體固定（2）固定：

固定劑多選用醛類（4%多聚甲醛?0.01mol/LPBS常用，pH7.4）；固定方法根據(jù)情況選定，多用灌流固定法（3）包埋及切片：

常用石蠟包埋切片和低溫冷凍包埋切片，無論哪種切片方法，都要求薄而平整，盡量避免因折疊或劃痕造成的非特異性著色（4）粘片、烤片及防脫片處理：

也可做漂片，即漂在液體里面進(jìn)行反應(yīng)5.免疫組織化學(xué)標(biāo)本的制備特點(diǎn)一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述抗體與抗原的特異性反應(yīng)是免疫組織化學(xué)的核心，在標(biāo)本制備過程中，既要保存好組織與細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還要盡可能保存標(biāo)本的抗原量或免疫活性第13頁/共54頁6.抗原修復(fù)一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述抗原修復(fù)（antigenretrieval，AR）指暴露抗原被封閉或隱蔽的表位，恢復(fù)其原有的空間狀態(tài)，提高抗原陽性檢出率的過程常用方法：酶消化法（化學(xué)修復(fù)法）和熱修復(fù)法（物理修復(fù)法）兩種，大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，熱抗原修復(fù)法優(yōu)于酶消化法（1）酶消化法：去除覆蓋在抗原表位的雜蛋白，切斷蛋白分子間的交聯(lián)胰蛋白酶消化修復(fù)法：主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的修復(fù)。使用0.1%氯化鈣液（pH7.6）制成0.05%~0.1%胰蛋白酶液，37℃孵育切片15～30min（陳舊標(biāo)本適當(dāng)延長時(shí)間），之后用PBS洗滌3次，每次3min胃蛋白酶消化修復(fù)法：主要用于細(xì)胞外基質(zhì)抗原的修復(fù)。一般使用0.4%胃蛋白酶液，37℃孵育切片30～180min，之后用PBS洗滌3次，每次3min第14頁/共54頁6.抗原修復(fù)一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（2）熱修復(fù)法：削弱或打斷由鈣離子介導(dǎo)的化學(xué)鍵，減弱或消除蛋白分子的交聯(lián)；pH6.0的0.01mol/L枸椽酸鹽緩沖液效果最好微波抗原熱修復(fù):切片脫蠟到水后，經(jīng)蒸餾水洗后放入盛有枸椽酸鹽緩沖液的容器中，置微波爐內(nèi)，加熱，使溶液達(dá)92～98℃以上，持續(xù)10～15min。取出容器，室溫自然冷卻10～20min（切勿將切片從緩沖液中取出冷卻），以便使抗原表位能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型。從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，再用PBS沖洗兩次，每次3min煮沸抗原熱修復(fù):切片脫蠟到水后，放入盛有枸椽酸鹽緩沖液的小容器中，將此容器置于另一個(gè)盛有自來水的大容器中，電爐加熱至沸騰，待小容器的溫度達(dá)92～98℃時(shí)，再持續(xù)15～20min，然后離開電爐，室溫自然冷卻20～30min，從緩沖液中取出玻片，自然冷卻至室溫第15頁/共54頁7.免疫組織化學(xué)技術(shù)對照實(shí)驗(yàn)一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述理想的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果應(yīng)是特異性強(qiáng)、定位準(zhǔn)確、陽性反應(yīng)與陰性背景對比清晰。然而，由于免疫組織化學(xué)染色過程涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，多種因素可影響染色結(jié)果，最終可能出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象。為保證其特異性，排除非特異性染色，在染色過程中應(yīng)進(jìn)行一系列對照實(shí)驗(yàn)對某種新的靶抗原的確定，以下每種都必不可少，但在同類靶抗原的重復(fù)性后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可只設(shè)陽性對照和替代或空白對照對照實(shí)驗(yàn)的目的：保證其特異性，排除非特異性染色對照實(shí)驗(yàn)的分類：陽性對照和陰性對照（1）陽性對照：用已證實(shí)含靶抗原的陽性標(biāo)本與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行同樣處理的組織對照，其目的在于證實(shí)所用免疫組織化學(xué)染色步驟的有效性，排除假陰性的可能第16頁/共54頁（2）陰性對照：陰性組織對照：用已知不含有靶抗原的標(biāo)本與待檢測標(biāo)本同時(shí)染色的對照，結(jié)果應(yīng)為陰性陰性試劑對照：證實(shí)免疫組織化學(xué)所用試劑，尤其是第一抗體的特異性，是每一批免疫組織化學(xué)染色中不可缺少的對照實(shí)驗(yàn)替換實(shí)驗(yàn)：用與第一抗體同種屬的動物正常血清取代第一抗體空白實(shí)驗(yàn)：稀釋第一抗體的緩沖液如PBS代替第一抗體，必要時(shí)還可對第二抗體等做相應(yīng)的替換或空白實(shí)驗(yàn)吸收實(shí)驗(yàn)：先將第一抗體用過量的純化抗原中和吸收，使其結(jié)合位點(diǎn)全部被加入的抗原結(jié)合封閉，不能再與標(biāo)本內(nèi)的靶抗原結(jié)合反應(yīng)，再用這種吸收后的上清液替代第一抗體做免疫組織化學(xué)染色抑制實(shí)驗(yàn)：將待測標(biāo)本先用未標(biāo)記的第一抗體反應(yīng)，再用標(biāo)記的第一抗體反應(yīng)，該對照實(shí)驗(yàn)適用于直接法自身對照：在同一標(biāo)本上，特定結(jié)構(gòu)或區(qū)域靶抗原的陽性反應(yīng)與其他無關(guān)結(jié)構(gòu)或區(qū)域的陰性結(jié)果之間的對照7.免疫組織化學(xué)技術(shù)對照實(shí)驗(yàn)一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述第17頁/共54頁二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)將熒光作為標(biāo)記物的免疫組織化學(xué)技術(shù)，簡稱免疫熒光技術(shù)（1）基本原理將熒光素與已知抗體（或抗原）進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，將其作為分子探針與組織細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合形成含有熒光素的特異性抗原-抗體復(fù)合物復(fù)合物上的熒光素受激發(fā)光照射而發(fā)出各種顏色熒光，利用熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡觀察根據(jù)熒光所在部位，即可對組織細(xì)胞中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定位乃至定量研究常用的熒光色素包括：異硫氰酸熒光素（FITC）；四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）；四乙基羅丹明（RB200）；Texas紅（TexasRed）；澡紅蛋白（PE）；花青類染料（Cy2、Cy3、Cy5）；AlexaFluor系列；DylightFluor系列等第18頁/共54頁熒光素最大吸收光譜最大發(fā)射光譜熒光顏色免疫熒光組織化學(xué)常用的熒光素異硫氰酸熒光素（FITC）490～495nm520～530nm黃綠色四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（TRITC）550nm620nm橘紅色四乙基羅達(dá)明(RB200)570nm595～600nm橘紅色得克薩斯紅（texasred)590～595nm620～630mm紅色藻紅蛋白（PE）490～560nm595nm紅色Cy3550nm570nm紅色7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）354nm430nm藍(lán)色Cy5650nm670nm藍(lán)色二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)第19頁/共54頁二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法直接法：間接法：第20頁/共54頁二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法補(bǔ)體法：將新鮮補(bǔ)體與第一抗體混合后同時(shí)加在組織標(biāo)本上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反應(yīng)，形成抗原-抗體-補(bǔ)體-抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物（3）免疫熒光技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、靈敏、特異性高、省時(shí)不足：熒光標(biāo)本不能長期保存、觀察需要熒光顯微鏡第21頁/共54頁二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)（4）非特異性熒光染色的抑制或消除產(chǎn)生非特異性熒光的原因有多種：自發(fā)熒光，結(jié)締組織、衰老細(xì)胞與熒光素的非特異性吸附，組織中蛋白質(zhì)帶有過多的負(fù)電荷，含有內(nèi)源性免疫球蛋白和Fc受體，抗體濃度過高或漂洗不充分，抗體不純所出現(xiàn)的交叉反應(yīng)或標(biāo)記用的熒光素質(zhì)量差等原因消除非特異性熒光的方法主要有：選擇特異性強(qiáng)且效價(jià)高的間接熒光抗體載玻片、蓋玻片應(yīng)清潔，無自發(fā)熒光使用10%與第二抗體同種屬的非免疫血清（正常血清）和3%牛血清白蛋白（BSA）預(yù)先孵育切片以封閉標(biāo)本中的電荷基團(tuán)、內(nèi)源性免疫球蛋白和Fc受體用含10%與第二抗體同種屬的非免疫血清（正常血清）和3%BSA的PBS稀釋各種抗體，并加入0.05%的NaN3防腐。第一抗體應(yīng)高度稀釋，應(yīng)用相應(yīng)抗原-抗體反應(yīng)的最佳濃度每次抗體孵育后，用緩沖液充分漂洗多余的抗體如用油鏡觀察標(biāo)本，必須用無自發(fā)熒光的鏡油第22頁/共54頁FITCTRITC二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)（5）結(jié)果觀察和描述理想的陽性反應(yīng)：結(jié)構(gòu)清晰、背景干凈不顯色……描述：陽性產(chǎn)物定位在什么器官的什么部位？細(xì)胞內(nèi)或外？胞漿、胞核還是胞膜？或者形成某種特殊顆?；蚓€條或……？強(qiáng)弱如何?第23頁/共54頁三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)將酶作為標(biāo)記物的免疫組織化學(xué)技術(shù)（1）基本原理酶連接在抗體上，與特異性抗原結(jié)合形成復(fù)合物借助酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下顯示細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部各種抗原成分的定位，進(jìn)行定性和定量的研究常用的酶有：辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP）、葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase,GOD）等，其中以HRP最常用免疫酶法的優(yōu)點(diǎn)：酶反應(yīng)產(chǎn)物可用于光鏡和電鏡觀察、靈敏度高、定位準(zhǔn)確、對比度好、長期保存、用HE等染色方法進(jìn)行復(fù)染可顯示組織結(jié)構(gòu)背景免疫酶法缺點(diǎn)：多用石蠟切片導(dǎo)致操作時(shí)間較長，對抗原活性損傷大第24頁/共54頁三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法直接法：間接法：第25頁/共54頁三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法非標(biāo)記抗體法：不用化學(xué)方法使酶與抗體直接結(jié)合非標(biāo)記抗體酶法包括酶橋法、PAP法、APAAP法等第26頁/共54頁三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法非標(biāo)記抗體法：酶橋法抗相應(yīng)抗原的特異性兔抗體（如兔抗人IgG）；過量的橋抗體如羊抗兔IgG，使橋抗體的一個(gè)抗原結(jié)合部位與特異性抗體結(jié)合，留下另一個(gè)抗原結(jié)合部位與抗酶抗體（如兔抗過氧化物酶抗體）結(jié)合；兔抗過氧化物酶的抗體（IgG）；HRP第27頁/共54頁三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法非標(biāo)記抗體法：過氧化物酶-抗過氧化物酶法（PAP法）將酶和抗酶抗體制成PAP復(fù)合物，其余與酶橋法相同PAP復(fù)合物的制備：以辣根過氧化物酶作為抗原免疫動物，產(chǎn)生抗過氧化物酶抗體，所用動物種類應(yīng)和制備第一抗體的動物相同，如兔，然后，將抗過氧化物酶抗體與足量的過氧化物酶結(jié)合，制備成由3個(gè)過氧化物酶分子和兩個(gè)抗過氧化物酶抗體分子組成的環(huán)形復(fù)合物，其結(jié)構(gòu)異常穩(wěn)定第28頁/共54頁三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法非標(biāo)記抗體法：堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶法（APAAP法）原理與PAP法基本相同，用堿性磷酸酶（AP）替代HRPAPAAP復(fù)合物采用與制備PAP復(fù)合物類似的方法制備而成，由兩個(gè)AP分子和兩個(gè)抗AP抗體分子結(jié)合而成的環(huán)形復(fù)合物應(yīng)用于內(nèi)源性過氧化物酶較高的組織中抗原物質(zhì)的檢測第29頁/共54頁三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（3）結(jié)果觀察與描述（以PAP法為例）第30頁/共54頁三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（4）免疫酶組織化學(xué)技術(shù)注意事項(xiàng)切片固定后漂洗：用緩沖液（如PBS、TBS等）充分清洗組織切片，將固定劑和其他雜質(zhì)消除或抑制內(nèi)源性酶活性：使用酶底物預(yù)孵育（如H2O2）封閉：用10%與第二抗體同種屬的正常血清（如正常羊血清NGS）和3%牛血清白蛋白預(yù)先孵育切片以封閉標(biāo)本中的電荷基團(tuán)、內(nèi)源性免疫球蛋白和Fc受體特異性第一抗體：用封閉液稀釋，保證有陽性反應(yīng)的情況下選擇最稀濃度第二抗體：原則上應(yīng)用高濃度，以使盡可能多的第二抗體與第一抗體結(jié)合PBS漂洗：要充分DAB/H2O2溶液顯色：應(yīng)避光，并在配制后立即使用；顯色液的濃度不宜過高；DAB致癌NaN3防腐：如果第一抗體孵育時(shí)間較長，抗體在稀釋至工作濃度后，需加入0.05%的，但PAP復(fù)合物中不得加入NaN3根據(jù)需要選擇對比染色：若反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可復(fù)染細(xì)胞核；若反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞核內(nèi)，可復(fù)染細(xì)胞質(zhì)整個(gè)程序均需保持組織切片或者細(xì)胞涂片濕潤設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證方法的特異性第31頁/共54頁四、親和免疫組織化學(xué)技術(shù)相互之間具有高度親和力的兩種物質(zhì)互稱親和物質(zhì)對，如生物素（biotin）與親和素（avidin）、植物凝集素（1ectin）與糖類、葡萄球菌A蛋白（staphylococcalproteinA，SPA）與抗體的Fc片段將酶、熒光素等標(biāo)記物與親和物質(zhì)中一種連接，用另外一種親和物質(zhì)標(biāo)記抗體，從而對抗原進(jìn)行定位和定量分析有效放大抗原信號，提高敏感性，且其背景清晰生物素（維生素H）是一種含硫雜環(huán)單羧酸，通過其羧基與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，可對抗體進(jìn)行標(biāo)記而不影響抗體與抗原結(jié)合力，一分子抗體可結(jié)合多達(dá)150個(gè)生物素分子每個(gè)親和素有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，生物素對親和素的結(jié)合能力比抗體對抗原的結(jié)合能力高出100萬倍，兩者之間呈非共價(jià)結(jié)合，作用極快，一旦結(jié)合很難解離，并且不影響彼此的生物學(xué)活性將酶標(biāo)記在親和素上，抗體先識別抗原，然后親和素與生物素相結(jié)合，形成抗原-抗體-親和素-生物素-酶復(fù)合物，通過與酶的底物反應(yīng)得到可觀察的沉淀物或者其他可視物質(zhì)研究相應(yīng)抗原的分布、定量及變化規(guī)律等（1）基本原理（以生物素-親和素系統(tǒng)為例）第32頁/共54頁四、親和免疫組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）***敏感性高，特異性抗體和生物素化抗體均可高度稀釋，因此可明顯減少非特異性染色***

對于含內(nèi)源性生物素較高的組織，如肝、腎、白細(xì)胞等，在應(yīng)用ABC法染色前，應(yīng)先用0.04%的親和素和0.01%的生物素溶液分別作用20min左右，以消除內(nèi)源性生物素活性第33頁/共54頁四、親和免疫組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（SABC法）用鏈霉親和素代替ABC法中的親和素，鏈霉親合素與親和素一樣也具有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，與生物素的親和力更高，且不含糖基，可保持中性等電點(diǎn)，不與組織中的凝集素及內(nèi)源性生物素結(jié)合，也不與組織產(chǎn)生靜電結(jié)合鏈霉親和素-過氧化物酶法（SP法）SP法靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、非特異性背景染色更少第34頁/共54頁五、免疫金組織化學(xué)技術(shù)金屬或金屬蛋白在電子束穿過時(shí)能產(chǎn)生電子散射，在電鏡熒光屏上顯示為電子密度高的影像，因此將其標(biāo)記抗原或抗體后，可用于免疫電鏡對組織細(xì)胞特定抗原進(jìn)行定性、定位或定量研究某些情況下也可作為光鏡水平的免疫組織化學(xué)研究方法常用的金屬類物質(zhì)為膠體金和鐵蛋白，尤以膠體金最為常用用兩種或多種大小不同的金顆粒分別標(biāo)記不同抗體，在電鏡下對兩種或多種抗原進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記（1）免疫膠體金技術(shù)：用膠體金標(biāo)記抗體膠體金的制備氯金酸枸櫞酸鈉、鞣酸還原膠體金（膠體狀態(tài)）??????·***膠體金顆粒大小不同，顏色亦不同，5～20nm之間呈淡紅色，20～40nm之間呈深紅色，大于60nm的膠體金呈藍(lán)色，大于20nm可用于光鏡研究第35頁/共54頁五、免疫金組織化學(xué)技術(shù)金屬或金屬蛋白在電子束穿過時(shí)能產(chǎn)生電子散射，在電鏡熒光屏上顯示為電子密度高的影像，因此將其標(biāo)記抗原或抗體后，可用于免疫電鏡對組織細(xì)胞特定抗原進(jìn)行定性、定位或定量研究某些情況下也可作為光鏡水平的免疫組織化學(xué)研究方法常用的金屬類物質(zhì)為膠體金和鐵蛋白，尤以膠體金最為常用用兩種或多種大小不同的金顆粒分別標(biāo)記不同抗體，在電鏡下對兩種或多種抗原進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記（1）免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金間接法原理第36頁/共54頁五、免疫金組織化學(xué)技術(shù)（1）免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金間接法第37頁/共54頁五、免疫金組織化學(xué)技術(shù)（2）蛋白A膠體金技術(shù)：PAG法和PAG放大法蛋白A是從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上提取的蛋白質(zhì)分子，它能與各種哺乳動物大多數(shù)免疫球蛋白（IgG）分子的Fc段非特異性牢固結(jié)合親水性的蛋白A還能被吸附在帶有負(fù)電荷的疏水性膠體金表面，形成穩(wěn)定的蛋白A-金（proteinAgold，PAG）復(fù)合物蛋白A金（PAG）法和蛋白A膠體金放大法（PAG放大法）PAG法PAG放大法第38頁/共54頁五、免疫金組織化學(xué)技術(shù)（3）免疫金銀染色將免疫金染色法與銀顯影方法結(jié)合稱為免疫金銀染色（immunogold-sliverstaining，IGSS）法IGSS法的基本原理是，通過免疫反應(yīng)沉積在抗原部位的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，它催化還原劑對苯二酚將銀離子（Ag+）還原成金屬銀原子（Ag），后者被吸附而環(huán)繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼”，“銀殼”一旦形成其本身也具有催化作用，從而使更多銀離子還原，而使“銀殼”越來越大，光鏡下則可清楚地見到陽性反應(yīng)部位呈棕黑色，從而顯示不易被光鏡定位的較小金顆粒第39頁/共54頁六、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)定義：在同一組織或細(xì)胞內(nèi)顯示兩種或多種抗原成分的免疫組織化學(xué)方法稱雙重或多重免疫組織化學(xué)染色（doubleormultipleimmunohistochemicalstaining）應(yīng)用：分析不同組織、細(xì)胞與相關(guān)抗原的相互關(guān)系，或同一組織、細(xì)胞內(nèi)兩種或多種化學(xué)抗原之間的相互關(guān)系雙重或多重免疫組織化學(xué)染色的基本方法是用兩種或多種不同的標(biāo)記物標(biāo)記抗體后在同一標(biāo)本上同時(shí)或先后原位顯示兩種或多種不同的抗原雙重或多重免疫熒光染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法操作同免疫熒光直接法，操作簡單、特異性強(qiáng)、背景低、操作簡便、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，最多可同時(shí)檢測7種抗原，但靈敏度較差直接法---兩種或者多種抗原來源于不同種屬第40頁/共54頁七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重或多重免疫熒光染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法雙重或多重免疫熒光染色最好選用來源于不同種屬的第一抗體。因?yàn)閮煞N或多種第一抗體來源于不同種屬，每重染色之間無交叉反應(yīng)，其特異性高。每步抗體孵育時(shí)，可將不同的第一抗體或不同的第二抗體混合，操作程序和單標(biāo)染色一樣簡便間接法---兩種第一抗體來源于不同種屬（首選）雙重或多重免疫組織化學(xué)染色的基本方法是用兩種或多種不同的標(biāo)記物標(biāo)記抗體后在同一標(biāo)本上同時(shí)或先后原位顯示兩種或多種不同的抗原第41頁/共54頁七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重或多重免疫熒光染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來源于相同種屬交叉反應(yīng)示意圖如不進(jìn)行交叉反應(yīng)封閉處理，將識別A抗原的免疫熒光反應(yīng)和顯示B抗原的免疫熒光反應(yīng)分兩步進(jìn)行，那么第二種第一抗體會與第一種第二抗體結(jié)合，后一種第二抗體既與后一種第一抗體結(jié)合又與前一種第一抗體結(jié)合，以此類推，結(jié)果會產(chǎn)生交叉反應(yīng)第42頁/共54頁七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重或多重免疫熒光染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來源于相同種屬***為防止這種交叉反應(yīng)，必須在前一重染色時(shí)或染色后進(jìn)行交叉反應(yīng)阻斷處理，然后進(jìn)行下一重染色。常用的阻斷交叉反應(yīng)的方法有第一抗體種屬轉(zhuǎn)化法和正常血清-單價(jià)Fab片段兩步阻斷法兩種。第一抗體種屬轉(zhuǎn)化法A，小鼠抗A抗原抗體（第一種第一抗體）與抗原A結(jié)合；B，未標(biāo)記的驢抗小鼠IgG單價(jià)Fab片段與第一種第一抗體結(jié)合；C，紅色熒光素標(biāo)記的羊抗未標(biāo)記Fab片段抗體與結(jié)合在第一種第一抗體上的未標(biāo)記單價(jià)Fab片段結(jié)合；D，小鼠抗B抗原抗體（第二種第一抗體）與B抗原結(jié)合；E，綠色熒光素標(biāo)記的的羊抗小鼠抗體（第二種第二抗體）只與第二種第一抗體結(jié)合第43頁/共54頁七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重免疫熒光染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來源于相同種屬***為防止這種交叉反應(yīng)，必須在前一重染色時(shí)或染色后進(jìn)行交叉反應(yīng)阻斷處理，然后進(jìn)行下一重染色。常用的阻斷交叉反應(yīng)的方法有第一抗體種屬轉(zhuǎn)化法和正常血清-單價(jià)Fab片段兩步阻斷法兩種。正常血清-單價(jià)Fab片段兩步阻斷法A，紅色熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠抗體（第一種第二抗體）與結(jié)合在A抗原上的小鼠抗A抗原抗體（第一種第一抗體）結(jié)合；B，小鼠正常血清IgG封閉第一種第二抗體未結(jié)合的Fab片段；C，未標(biāo)記抗小鼠IgG單價(jià)Fab片段封閉第一種第一抗體和小鼠正常血清IgGFc段；D，綠色熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠抗體（第二種第二抗體）只與第二種第一抗體的Fc段結(jié)合第44頁/共54頁七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重免疫酶染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來源于不同種屬雙重免疫酶組織化學(xué)染色先以不同酶標(biāo)記的抗體按照免疫學(xué)原理與相應(yīng)抗原結(jié)合，然后應(yīng)用酶組織化學(xué)原理，以結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的酶催化不同底物呈現(xiàn)不同顏色產(chǎn)物，顯示同一標(biāo)本內(nèi)兩種或多種抗原單酶雙底物法：該方法采用同一種酶標(biāo)記兩種不同的第二抗體，在用兩種第一抗體混合物同時(shí)孵育標(biāo)本后，先用酶（如HRP）標(biāo)記的第一種第二抗體孵育標(biāo)本，與其中的第一種第一抗體結(jié)合，用相應(yīng)的酶底物（如H2O2/DAB）反應(yīng)形成一種顏色的反應(yīng)產(chǎn)物（如棕褐色）以顯示第一種抗原，繼而用同一種酶標(biāo)記的第二種第二抗體孵育標(biāo)本，與其中的第二種第一抗體結(jié)合，用另一種酶底物（如H2O2/4-CN）反應(yīng)形成另一種顏色的反應(yīng)產(chǎn)物（如藍(lán)色）以顯示另一種抗原。第45頁/共54頁七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重免疫酶染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來源于不同種屬雙酶雙底物法（PAP法與APAAP法）：該方法采用兩種不同酶（如HRP和AP）分別標(biāo)記兩種不同的第二抗體，在用兩種第一抗體混合孵育標(biāo)本后，繼而用兩種標(biāo)記不同酶的第二抗體混合孵育標(biāo)本，然后用兩種不同酶的底物（如H2O2/DAB和磷酸萘酚/快藍(lán)或BCIP/NBT）先后反應(yīng)，以此形成不同顏色（如棕褐色和藍(lán)色）的反應(yīng)產(chǎn)物。由于兩種第一抗體和第二抗體均可混合后同時(shí)孵育標(biāo)本，因此，雙酶雙底物法較單酶雙底物法簡便、省時(shí)第46頁/共54頁七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來源于不同種屬雙酶雙底物法：用兩種生物素化的第二抗體代替雙酶雙底物法中的兩種酶標(biāo)記第二抗體，分別用親和素-HRP-H2O2/DAB顯色系統(tǒng)和AP-磷酸萘酚/快藍(lán)或BCIP/NBT顯色系統(tǒng)顯示兩種不同的抗原。過程較繁瑣，但敏感度較高雙重親和免疫組織化學(xué)染色第47頁/共54頁七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法混合型雙重或多重免疫組織化學(xué)染色是指將兩種或多種不同類型的標(biāo)記物結(jié)合進(jìn)行的雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，如將酶標(biāo)記與熒光素標(biāo)記結(jié)合、膠體金（銀）標(biāo)記與酶標(biāo)記結(jié)合等。在光鏡水平，這種混合法較少用，而在