現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)碩研

現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)碩研第1頁(yè)/共54頁(yè)ABC法顯示胰島B細(xì)胞ABC法顯示胰島A細(xì)胞ABC法顯示胰島D細(xì)胞H-E染色法顯示胰腺的胰島第2頁(yè)/共54頁(yè)2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述組織抗原標(biāo)記物被標(biāo)記的抗體標(biāo)記抗體與組織抗原特異性結(jié)合免疫學(xué)依據(jù)抗體抗原抗原–

抗體復(fù)合物＋特異性結(jié)合原理包括：抗原-抗體反應(yīng)、免疫標(biāo)記反應(yīng)和呈色反應(yīng)第3頁(yè)/共54頁(yè)2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）抗原-抗體反應(yīng)：抗原（antigen）：是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)，多為蛋白、多肽等分子免疫原性（immunogenicity）抗原分子具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抗原分子表面的一些特殊化學(xué)活性基團(tuán)（即表位或稱抗原決定簇）刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和/或致敏淋巴細(xì)胞反應(yīng)原性（reactogenicity）抗原分子能與抗體或致敏淋巴細(xì)胞等免疫應(yīng)答的效應(yīng)物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合完全抗原和半抗原：同時(shí)具有上述兩種能力的抗原稱為完全抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、病原微生物等；只有反應(yīng)原性而不具有免疫原性的稱為半抗原（hapten），與大分子載體結(jié)合后可獲得免疫原性，大多數(shù)多糖和類脂均屬于半抗原抗原的異物性：異種抗原、異體抗原（同種異體）、自身抗原第4頁(yè)/共54頁(yè)2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）抗原-抗體反應(yīng)：抗體（antibody）：機(jī)體在抗原刺激下，通過(guò)體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的一類能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）N端C端重鏈（H鏈）N端1/4區(qū)域內(nèi)和輕鏈（L鏈）N段1/2區(qū)域內(nèi)的氨基酸組成和順序隨免疫的抗原不同而異，稱為可變區(qū)（variableregion,V區(qū)），決定與特定抗原結(jié)合的特異性。免疫球蛋白分子V區(qū)以外的部分稱為恒定區(qū)（constantregion，C區(qū)），其氨基酸組成和順序在同一種屬動(dòng)物中相對(duì)穩(wěn)定，具有相同的抗原性第5頁(yè)/共54頁(yè)抗體經(jīng)酶水解后的產(chǎn)物木瓜蛋白酶水解:：兩個(gè)相同的單抗原結(jié)合片段Fab和一個(gè)Fc片段胃蛋白酶消化：一個(gè)較大的F(ab’)2和一個(gè)Fc’片段***Fab和F(ab’)2均保留抗體活性，F(xiàn)c不能與抗原結(jié)合，但具有各類免疫球蛋白的表位和免疫原性，F(xiàn)c’繼續(xù)被胃蛋白酶水解成更小的片段，不再具有免疫原性2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）抗原-抗體反應(yīng)：抗體（antibody）第6頁(yè)/共54頁(yè)抗體的種類制備途徑不同：多克隆抗體：由于一種抗原一般具有多種表位，免疫動(dòng)物后，誘導(dǎo)動(dòng)物多個(gè)B細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)化為多個(gè)漿細(xì)胞克隆，產(chǎn)生識(shí)別多個(gè)不同表位的抗體，這種含有能與同一抗原多種表位結(jié)合的混合物稱多克隆抗體（polyclonalantibody）單克隆抗體：?jiǎn)慰寺】贵w（monoclonalantibody）是針對(duì)一種抗原的單個(gè)表位產(chǎn)生的抗體，由一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)無(wú)性繁殖而來(lái)的細(xì)胞群所產(chǎn)生基因工程抗體：基因工程抗體（geneticallyengineeredantibody）是采用基因重組技術(shù)及蛋白質(zhì)工程技術(shù)，在基因及蛋白質(zhì)水平上直接切割、拼接或修飾組裝的抗體，具有特異性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更好、可批量大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)動(dòng)物來(lái)源不同：兔抗體、小鼠抗體、大鼠抗體、羊抗體、驢抗體等應(yīng)用順序不同：第一抗體、第二抗體和第三抗體2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）抗原-抗體反應(yīng)：抗體（antibody）第7頁(yè)/共54頁(yè)抗體的選擇，稀釋及保存

抗體獲得：從試劑公司訂購(gòu)商品化的抗體、自己制備（或通過(guò)文獻(xiàn)檢索，向相關(guān)實(shí)驗(yàn)室或作者索求）抗體的保存：從公司購(gòu)買的抗體一般為凍干粉、原液或用特制稀釋液配制的即用型抗體，應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行保存和使用。長(zhǎng)期不用的抗體可以分裝后在-80℃低溫冰箱保存，或者加入等體積的甘油，然后放入-20℃冰箱保存，可以防止結(jié)冰，有效期可長(zhǎng)達(dá)數(shù)年。盛裝抗體的容器要有良好的密封性，并用蠟?zāi)し饪?，以防脫水干燥。短期?nèi)頻繁使用的抗體可在4℃保存數(shù)周，無(wú)需放入低溫冰箱，以免反復(fù)凍融使抗體的效價(jià)下降，但需加入防腐劑疊氮鈉（NaN3）以防止抗體變質(zhì)。對(duì)于已稀釋過(guò)的抗體（使用特制稀釋液除外），最好在一周內(nèi)用完，不宜長(zhǎng)期保存抗體的濃度選擇：非越濃越好（前帶效應(yīng)prozoneeffect：抗體分子過(guò)多導(dǎo)致陽(yáng)性反應(yīng)減弱甚至假陰性）2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）抗原-抗體反應(yīng)：抗體（antibody）第8頁(yè)/共54頁(yè)2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（2）免疫標(biāo)記反應(yīng)：定義：用標(biāo)記物或示蹤劑將抗體標(biāo)記，以使標(biāo)記抗體與抗原發(fā)生特異性結(jié)合后能利用標(biāo)記物與其他物質(zhì)的反應(yīng)、放大并轉(zhuǎn)換為可見(jiàn)的有色物質(zhì)或發(fā)光物，繼而通過(guò)相應(yīng)的顯微鏡直接觀察標(biāo)記物應(yīng)具有以下特點(diǎn)：能與抗體形成牢固的共價(jià)結(jié)合不影響抗體與抗原的結(jié)合放大效率高發(fā)光或顯色反應(yīng)要在抗原-抗體結(jié)合的原位并且鮮明，有良好的對(duì)比***

常用的標(biāo)記物有熒光素、酶、親和物質(zhì)、金屬顆粒、放射性核素等***如要對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測(cè)，也可用標(biāo)記物將相應(yīng)抗原進(jìn)行標(biāo)記第9頁(yè)/共54頁(yè)2.免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（3）呈色反應(yīng)：定義：利用傳統(tǒng)的組織化學(xué)技術(shù)，使在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的免疫反應(yīng)復(fù)合物中的抗體上的標(biāo)記物又與其他物質(zhì)反應(yīng)，形成可見(jiàn)的有色沉淀，或發(fā)出熒光，最后用普通顯微鏡、電子顯微鏡或熒光顯微鏡觀察反應(yīng)產(chǎn)物或熒光3.免疫組織化學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)：抗體高度特異抗原敏感性高：最大限度保存組織或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)物質(zhì)的抗原性、采用高敏感、高親和力的抗體和標(biāo)記復(fù)合物、多步放大免疫反應(yīng)、先進(jìn)的檢測(cè)設(shè)備形態(tài)、功能和代謝密切結(jié)合：保持了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)對(duì)組織細(xì)胞的檢測(cè)觀察客觀、仔細(xì)的優(yōu)點(diǎn)、克服了傳統(tǒng)免疫學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng)只能定性和定量，不能定位的缺點(diǎn)第10頁(yè)/共54頁(yè)4.免疫組織化學(xué)技術(shù)的分類一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（1）標(biāo)記物不同免疫熒光組織化學(xué)（immunofluorescencehistochemistry）：用熒光素作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體，在熒光顯微鏡下觀察抗原抗體反應(yīng)部位免疫酶組織化學(xué)（immunoenzymatichistochemistry）：用酶標(biāo)記抗體，其中酶又催化底物形成有色沉淀，在顯微鏡下觀察顯色產(chǎn)物親和免疫組織化學(xué)（affinityimmunohistochemistry）：利用某些物質(zhì)間具有高度親和力的特點(diǎn)，在免疫組織化學(xué)方法中建立有效的抗原信號(hào)放大系統(tǒng)免疫金組織化學(xué)（immunogoldhistochemistry）：用金顆粒（如膠體金）作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體，根據(jù)膠體金顆粒呈粉紅色或具有高電子密度，在光鏡或電鏡下觀察組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物第11頁(yè)/共54頁(yè)（2）根據(jù)標(biāo)記物是否與特異性第一抗體結(jié)合直接法：將特異性第一抗體用標(biāo)記物標(biāo)記，直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原結(jié)合；特異性強(qiáng)、靈敏度差***擬檢抗原種類繁多，將標(biāo)記物直接標(biāo)記在其特異性抗體上成本高，商品化可能性低間接法：對(duì)第二抗體進(jìn)行標(biāo)記，其中第一抗體可特異性結(jié)合組織或細(xì)胞中的待檢抗原，第二抗體與第一抗體的Fc段結(jié)合

***優(yōu)點(diǎn)：信息放大、提高反應(yīng)的敏感性；只要有一種動(dòng)物的標(biāo)記第二抗體，便可用于該種動(dòng)物的所有特異性第一抗體------間接法較直接法更為實(shí)用4.免疫組織化學(xué)技術(shù)的分類一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述第12頁(yè)/共54頁(yè)（1）取材：

準(zhǔn)確、迅速、大小合適、離體固定（2）固定：

固定劑多選用醛類（4%多聚甲醛?0.01mol/LPBS常用，pH7.4）；固定方法根據(jù)情況選定，多用灌流固定法（3）包埋及切片：

常用石蠟包埋切片和低溫冷凍包埋切片，無(wú)論哪種切片方法，都要求薄而平整，盡量避免因折疊或劃痕造成的非特異性著色（4）粘片、烤片及防脫片處理：

也可做漂片，即漂在液體里面進(jìn)行反應(yīng)5.免疫組織化學(xué)標(biāo)本的制備特點(diǎn)一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述抗體與抗原的特異性反應(yīng)是免疫組織化學(xué)的核心，在標(biāo)本制備過(guò)程中，既要保存好組織與細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還要盡可能保存標(biāo)本的抗原量或免疫活性第13頁(yè)/共54頁(yè)6.抗原修復(fù)一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述抗原修復(fù)（antigenretrieval，AR）指暴露抗原被封閉或隱蔽的表位，恢復(fù)其原有的空間狀態(tài)，提高抗原陽(yáng)性檢出率的過(guò)程常用方法：酶消化法（化學(xué)修復(fù)法）和熱修復(fù)法（物理修復(fù)法）兩種，大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，熱抗原修復(fù)法優(yōu)于酶消化法（1）酶消化法：去除覆蓋在抗原表位的雜蛋白，切斷蛋白分子間的交聯(lián)胰蛋白酶消化修復(fù)法：主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的修復(fù)。使用0.1%氯化鈣液（pH7.6）制成0.05%~0.1%胰蛋白酶液，37℃孵育切片15～30min（陳舊標(biāo)本適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間），之后用PBS洗滌3次，每次3min胃蛋白酶消化修復(fù)法：主要用于細(xì)胞外基質(zhì)抗原的修復(fù)。一般使用0.4%胃蛋白酶液，37℃孵育切片30～180min，之后用PBS洗滌3次，每次3min第14頁(yè)/共54頁(yè)6.抗原修復(fù)一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述（2）熱修復(fù)法：削弱或打斷由鈣離子介導(dǎo)的化學(xué)鍵，減弱或消除蛋白分子的交聯(lián)；pH6.0的0.01mol/L枸椽酸鹽緩沖液效果最好微波抗原熱修復(fù):切片脫蠟到水后，經(jīng)蒸餾水洗后放入盛有枸椽酸鹽緩沖液的容器中，置微波爐內(nèi)，加熱，使溶液達(dá)92～98℃以上，持續(xù)10～15min。取出容器，室溫自然冷卻10～20min（切勿將切片從緩沖液中取出冷卻），以便使抗原表位能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型。從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，再用PBS沖洗兩次，每次3min煮沸抗原熱修復(fù):切片脫蠟到水后，放入盛有枸椽酸鹽緩沖液的小容器中，將此容器置于另一個(gè)盛有自來(lái)水的大容器中，電爐加熱至沸騰，待小容器的溫度達(dá)92～98℃時(shí)，再持續(xù)15～20min，然后離開(kāi)電爐，室溫自然冷卻20～30min，從緩沖液中取出玻片，自然冷卻至室溫第15頁(yè)/共54頁(yè)7.免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述理想的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果應(yīng)是特異性強(qiáng)、定位準(zhǔn)確、陽(yáng)性反應(yīng)與陰性背景對(duì)比清晰。然而，由于免疫組織化學(xué)染色過(guò)程涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，多種因素可影響染色結(jié)果，最終可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性現(xiàn)象。為保證其特異性，排除非特異性染色，在染色過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)某種新的靶抗原的確定，以下每種都必不可少，但在同類靶抗原的重復(fù)性后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可只設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和替代或空白對(duì)照對(duì)照實(shí)驗(yàn)的目的：保證其特異性，排除非特異性染色對(duì)照實(shí)驗(yàn)的分類：陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照（1）陽(yáng)性對(duì)照：用已證實(shí)含靶抗原的陽(yáng)性標(biāo)本與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行同樣處理的組織對(duì)照，其目的在于證實(shí)所用免疫組織化學(xué)染色步驟的有效性，排除假陰性的可能第16頁(yè)/共54頁(yè)（2）陰性對(duì)照：陰性組織對(duì)照：用已知不含有靶抗原的標(biāo)本與待檢測(cè)標(biāo)本同時(shí)染色的對(duì)照，結(jié)果應(yīng)為陰性陰性試劑對(duì)照：證實(shí)免疫組織化學(xué)所用試劑，尤其是第一抗體的特異性，是每一批免疫組織化學(xué)染色中不可缺少的對(duì)照實(shí)驗(yàn)替換實(shí)驗(yàn)：用與第一抗體同種屬的動(dòng)物正常血清取代第一抗體空白實(shí)驗(yàn)：稀釋第一抗體的緩沖液如PBS代替第一抗體，必要時(shí)還可對(duì)第二抗體等做相應(yīng)的替換或空白實(shí)驗(yàn)吸收實(shí)驗(yàn)：先將第一抗體用過(guò)量的純化抗原中和吸收，使其結(jié)合位點(diǎn)全部被加入的抗原結(jié)合封閉，不能再與標(biāo)本內(nèi)的靶抗原結(jié)合反應(yīng)，再用這種吸收后的上清液替代第一抗體做免疫組織化學(xué)染色抑制實(shí)驗(yàn)：將待測(cè)標(biāo)本先用未標(biāo)記的第一抗體反應(yīng)，再用標(biāo)記的第一抗體反應(yīng)，該對(duì)照實(shí)驗(yàn)適用于直接法自身對(duì)照：在同一標(biāo)本上，特定結(jié)構(gòu)或區(qū)域靶抗原的陽(yáng)性反應(yīng)與其他無(wú)關(guān)結(jié)構(gòu)或區(qū)域的陰性結(jié)果之間的對(duì)照7.免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)一、免疫組織化學(xué)技術(shù)概述第17頁(yè)/共54頁(yè)二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)將熒光作為標(biāo)記物的免疫組織化學(xué)技術(shù)，簡(jiǎn)稱免疫熒光技術(shù)（1）基本原理將熒光素與已知抗體（或抗原）進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，將其作為分子探針與組織細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合形成含有熒光素的特異性抗原-抗體復(fù)合物復(fù)合物上的熒光素受激發(fā)光照射而發(fā)出各種顏色熒光，利用熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡觀察根據(jù)熒光所在部位，即可對(duì)組織細(xì)胞中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定位乃至定量研究常用的熒光色素包括：異硫氰酸熒光素（FITC）；四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）；四乙基羅丹明（RB200）；Texas紅（TexasRed）；澡紅蛋白（PE）；花青類染料（Cy2、Cy3、Cy5）；AlexaFluor系列；DylightFluor系列等第18頁(yè)/共54頁(yè)熒光素最大吸收光譜最大發(fā)射光譜熒光顏色免疫熒光組織化學(xué)常用的熒光素異硫氰酸熒光素（FITC）490～495nm520～530nm黃綠色四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（TRITC）550nm620nm橘紅色四乙基羅達(dá)明(RB200)570nm595～600nm橘紅色得克薩斯紅（texasred)590～595nm620～630mm紅色藻紅蛋白（PE）490～560nm595nm紅色Cy3550nm570nm紅色7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）354nm430nm藍(lán)色Cy5650nm670nm藍(lán)色二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)第19頁(yè)/共54頁(yè)二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法直接法：間接法：第20頁(yè)/共54頁(yè)二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法補(bǔ)體法：將新鮮補(bǔ)體與第一抗體混合后同時(shí)加在組織標(biāo)本上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反應(yīng)，形成抗原-抗體-補(bǔ)體-抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物（3）免疫熒光技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、靈敏、特異性高、省時(shí)不足：熒光標(biāo)本不能長(zhǎng)期保存、觀察需要熒光顯微鏡第21頁(yè)/共54頁(yè)二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)（4）非特異性熒光染色的抑制或消除產(chǎn)生非特異性熒光的原因有多種：自發(fā)熒光，結(jié)締組織、衰老細(xì)胞與熒光素的非特異性吸附，組織中蛋白質(zhì)帶有過(guò)多的負(fù)電荷，含有內(nèi)源性免疫球蛋白和Fc受體，抗體濃度過(guò)高或漂洗不充分，抗體不純所出現(xiàn)的交叉反應(yīng)或標(biāo)記用的熒光素質(zhì)量差等原因消除非特異性熒光的方法主要有：選擇特異性強(qiáng)且效價(jià)高的間接熒光抗體載玻片、蓋玻片應(yīng)清潔，無(wú)自發(fā)熒光使用10%與第二抗體同種屬的非免疫血清（正常血清）和3%牛血清白蛋白（BSA）預(yù)先孵育切片以封閉標(biāo)本中的電荷基團(tuán)、內(nèi)源性免疫球蛋白和Fc受體用含10%與第二抗體同種屬的非免疫血清（正常血清）和3%BSA的PBS稀釋各種抗體，并加入0.05%的NaN3防腐。第一抗體應(yīng)高度稀釋，應(yīng)用相應(yīng)抗原-抗體反應(yīng)的最佳濃度每次抗體孵育后，用緩沖液充分漂洗多余的抗體如用油鏡觀察標(biāo)本，必須用無(wú)自發(fā)熒光的鏡油第22頁(yè)/共54頁(yè)FITCTRITC二、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)（5）結(jié)果觀察和描述理想的陽(yáng)性反應(yīng)：結(jié)構(gòu)清晰、背景干凈不顯色……描述：陽(yáng)性產(chǎn)物定位在什么器官的什么部位？細(xì)胞內(nèi)或外？胞漿、胞核還是胞膜？或者形成某種特殊顆粒或線條或……？強(qiáng)弱如何?第23頁(yè)/共54頁(yè)三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)將酶作為標(biāo)記物的免疫組織化學(xué)技術(shù)（1）基本原理酶連接在抗體上，與特異性抗原結(jié)合形成復(fù)合物借助酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下顯示細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部各種抗原成分的定位，進(jìn)行定性和定量的研究常用的酶有：辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP）、葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase,GOD）等，其中以HRP最常用免疫酶法的優(yōu)點(diǎn)：酶反應(yīng)產(chǎn)物可用于光鏡和電鏡觀察、靈敏度高、定位準(zhǔn)確、對(duì)比度好、長(zhǎng)期保存、用HE等染色方法進(jìn)行復(fù)染可顯示組織結(jié)構(gòu)背景免疫酶法缺點(diǎn)：多用石蠟切片導(dǎo)致操作時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)抗原活性損傷大第24頁(yè)/共54頁(yè)三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法直接法：間接法：第25頁(yè)/共54頁(yè)三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法非標(biāo)記抗體法：不用化學(xué)方法使酶與抗體直接結(jié)合非標(biāo)記抗體酶法包括酶橋法、PAP法、APAAP法等第26頁(yè)/共54頁(yè)三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法非標(biāo)記抗體法：酶橋法抗相應(yīng)抗原的特異性兔抗體（如兔抗人IgG）；過(guò)量的橋抗體如羊抗兔IgG，使橋抗體的一個(gè)抗原結(jié)合部位與特異性抗體結(jié)合，留下另一個(gè)抗原結(jié)合部位與抗酶抗體（如兔抗過(guò)氧化物酶抗體）結(jié)合；兔抗過(guò)氧化物酶的抗體（IgG）；HRP第27頁(yè)/共54頁(yè)三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法非標(biāo)記抗體法：過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶法（PAP法）將酶和抗酶抗體制成PAP復(fù)合物，其余與酶橋法相同PAP復(fù)合物的制備：以辣根過(guò)氧化物酶作為抗原免疫動(dòng)物，產(chǎn)生抗過(guò)氧化物酶抗體，所用動(dòng)物種類應(yīng)和制備第一抗體的動(dòng)物相同，如兔，然后，將抗過(guò)氧化物酶抗體與足量的過(guò)氧化物酶結(jié)合，制備成由3個(gè)過(guò)氧化物酶分子和兩個(gè)抗過(guò)氧化物酶抗體分子組成的環(huán)形復(fù)合物，其結(jié)構(gòu)異常穩(wěn)定第28頁(yè)/共54頁(yè)三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法非標(biāo)記抗體法：堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶法（APAAP法）原理與PAP法基本相同，用堿性磷酸酶（AP）替代HRPAPAAP復(fù)合物采用與制備PAP復(fù)合物類似的方法制備而成，由兩個(gè)AP分子和兩個(gè)抗AP抗體分子結(jié)合而成的環(huán)形復(fù)合物應(yīng)用于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶較高的組織中抗原物質(zhì)的檢測(cè)第29頁(yè)/共54頁(yè)三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（3）結(jié)果觀察與描述（以PAP法為例）第30頁(yè)/共54頁(yè)三、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（4）免疫酶組織化學(xué)技術(shù)注意事項(xiàng)切片固定后漂洗：用緩沖液（如PBS、TBS等）充分清洗組織切片，將固定劑和其他雜質(zhì)消除或抑制內(nèi)源性酶活性：使用酶底物預(yù)孵育（如H2O2）封閉：用10%與第二抗體同種屬的正常血清（如正常羊血清NGS）和3%牛血清白蛋白預(yù)先孵育切片以封閉標(biāo)本中的電荷基團(tuán)、內(nèi)源性免疫球蛋白和Fc受體特異性第一抗體：用封閉液稀釋，保證有陽(yáng)性反應(yīng)的情況下選擇最稀濃度第二抗體：原則上應(yīng)用高濃度，以使盡可能多的第二抗體與第一抗體結(jié)合PBS漂洗：要充分DAB/H2O2溶液顯色：應(yīng)避光，并在配制后立即使用；顯色液的濃度不宜過(guò)高；DAB致癌NaN3防腐：如果第一抗體孵育時(shí)間較長(zhǎng)，抗體在稀釋至工作濃度后，需加入0.05%的，但PAP復(fù)合物中不得加入NaN3根據(jù)需要選擇對(duì)比染色：若反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可復(fù)染細(xì)胞核；若反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞核內(nèi)，可復(fù)染細(xì)胞質(zhì)整個(gè)程序均需保持組織切片或者細(xì)胞涂片濕潤(rùn)設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證方法的特異性第31頁(yè)/共54頁(yè)四、親和免疫組織化學(xué)技術(shù)相互之間具有高度親和力的兩種物質(zhì)互稱親和物質(zhì)對(duì)，如生物素（biotin）與親和素（avidin）、植物凝集素（1ectin）與糖類、葡萄球菌A蛋白（staphylococcalproteinA，SPA）與抗體的Fc片段將酶、熒光素等標(biāo)記物與親和物質(zhì)中一種連接，用另外一種親和物質(zhì)標(biāo)記抗體，從而對(duì)抗原進(jìn)行定位和定量分析有效放大抗原信號(hào)，提高敏感性，且其背景清晰生物素（維生素H）是一種含硫雜環(huán)單羧酸，通過(guò)其羧基與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，可對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記而不影響抗體與抗原結(jié)合力，一分子抗體可結(jié)合多達(dá)150個(gè)生物素分子每個(gè)親和素有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，生物素對(duì)親和素的結(jié)合能力比抗體對(duì)抗原的結(jié)合能力高出100萬(wàn)倍，兩者之間呈非共價(jià)結(jié)合，作用極快，一旦結(jié)合很難解離，并且不影響彼此的生物學(xué)活性將酶標(biāo)記在親和素上，抗體先識(shí)別抗原，然后親和素與生物素相結(jié)合，形成抗原-抗體-親和素-生物素-酶復(fù)合物，通過(guò)與酶的底物反應(yīng)得到可觀察的沉淀物或者其他可視物質(zhì)研究相應(yīng)抗原的分布、定量及變化規(guī)律等（1）基本原理（以生物素-親和素系統(tǒng)為例）第32頁(yè)/共54頁(yè)四、親和免疫組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）***敏感性高，特異性抗體和生物素化抗體均可高度稀釋，因此可明顯減少非特異性染色***

對(duì)于含內(nèi)源性生物素較高的組織，如肝、腎、白細(xì)胞等，在應(yīng)用ABC法染色前，應(yīng)先用0.04%的親和素和0.01%的生物素溶液分別作用20min左右，以消除內(nèi)源性生物素活性第33頁(yè)/共54頁(yè)四、親和免疫組織化學(xué)技術(shù)（2）基本方法鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（SABC法）用鏈霉親和素代替ABC法中的親和素，鏈霉親合素與親和素一樣也具有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，與生物素的親和力更高，且不含糖基，可保持中性等電點(diǎn)，不與組織中的凝集素及內(nèi)源性生物素結(jié)合，也不與組織產(chǎn)生靜電結(jié)合鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶法（SP法）SP法靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、非特異性背景染色更少第34頁(yè)/共54頁(yè)五、免疫金組織化學(xué)技術(shù)金屬或金屬蛋白在電子束穿過(guò)時(shí)能產(chǎn)生電子散射，在電鏡熒光屏上顯示為電子密度高的影像，因此將其標(biāo)記抗原或抗體后，可用于免疫電鏡對(duì)組織細(xì)胞特定抗原進(jìn)行定性、定位或定量研究某些情況下也可作為光鏡水平的免疫組織化學(xué)研究方法常用的金屬類物質(zhì)為膠體金和鐵蛋白，尤以膠體金最為常用用兩種或多種大小不同的金顆粒分別標(biāo)記不同抗體，在電鏡下對(duì)兩種或多種抗原進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記（1）免疫膠體金技術(shù)：用膠體金標(biāo)記抗體膠體金的制備氯金酸枸櫞酸鈉、鞣酸還原膠體金（膠體狀態(tài)）??????·***膠體金顆粒大小不同，顏色亦不同，5～20nm之間呈淡紅色，20～40nm之間呈深紅色，大于60nm的膠體金呈藍(lán)色，大于20nm可用于光鏡研究第35頁(yè)/共54頁(yè)五、免疫金組織化學(xué)技術(shù)金屬或金屬蛋白在電子束穿過(guò)時(shí)能產(chǎn)生電子散射，在電鏡熒光屏上顯示為電子密度高的影像，因此將其標(biāo)記抗原或抗體后，可用于免疫電鏡對(duì)組織細(xì)胞特定抗原進(jìn)行定性、定位或定量研究某些情況下也可作為光鏡水平的免疫組織化學(xué)研究方法常用的金屬類物質(zhì)為膠體金和鐵蛋白，尤以膠體金最為常用用兩種或多種大小不同的金顆粒分別標(biāo)記不同抗體，在電鏡下對(duì)兩種或多種抗原進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記（1）免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金間接法原理第36頁(yè)/共54頁(yè)五、免疫金組織化學(xué)技術(shù)（1）免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金間接法第37頁(yè)/共54頁(yè)五、免疫金組織化學(xué)技術(shù)（2）蛋白A膠體金技術(shù)：PAG法和PAG放大法蛋白A是從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上提取的蛋白質(zhì)分子，它能與各種哺乳動(dòng)物大多數(shù)免疫球蛋白（IgG）分子的Fc段非特異性牢固結(jié)合親水性的蛋白A還能被吸附在帶有負(fù)電荷的疏水性膠體金表面，形成穩(wěn)定的蛋白A-金（proteinAgold，PAG）復(fù)合物蛋白A金（PAG）法和蛋白A膠體金放大法（PAG放大法）PAG法PAG放大法第38頁(yè)/共54頁(yè)五、免疫金組織化學(xué)技術(shù)（3）免疫金銀染色將免疫金染色法與銀顯影方法結(jié)合稱為免疫金銀染色（immunogold-sliverstaining，IGSS）法IGSS法的基本原理是，通過(guò)免疫反應(yīng)沉積在抗原部位的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，它催化還原劑對(duì)苯二酚將銀離子（Ag+）還原成金屬銀原子（Ag），后者被吸附而環(huán)繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼”，“銀殼”一旦形成其本身也具有催化作用，從而使更多銀離子還原，而使“銀殼”越來(lái)越大，光鏡下則可清楚地見(jiàn)到陽(yáng)性反應(yīng)部位呈棕黑色，從而顯示不易被光鏡定位的較小金顆粒第39頁(yè)/共54頁(yè)六、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)定義：在同一組織或細(xì)胞內(nèi)顯示兩種或多種抗原成分的免疫組織化學(xué)方法稱雙重或多重免疫組織化學(xué)染色（doubleormultipleimmunohistochemicalstaining）應(yīng)用：分析不同組織、細(xì)胞與相關(guān)抗原的相互關(guān)系，或同一組織、細(xì)胞內(nèi)兩種或多種化學(xué)抗原之間的相互關(guān)系雙重或多重免疫組織化學(xué)染色的基本方法是用兩種或多種不同的標(biāo)記物標(biāo)記抗體后在同一標(biāo)本上同時(shí)或先后原位顯示兩種或多種不同的抗原雙重或多重免疫熒光染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法操作同免疫熒光直接法，操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、背景低、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，最多可同時(shí)檢測(cè)7種抗原，但靈敏度較差直接法---兩種或者多種抗原來(lái)源于不同種屬第40頁(yè)/共54頁(yè)七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重或多重免疫熒光染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法雙重或多重免疫熒光染色最好選用來(lái)源于不同種屬的第一抗體。因?yàn)閮煞N或多種第一抗體來(lái)源于不同種屬，每重染色之間無(wú)交叉反應(yīng)，其特異性高。每步抗體孵育時(shí)，可將不同的第一抗體或不同的第二抗體混合，操作程序和單標(biāo)染色一樣簡(jiǎn)便間接法---兩種第一抗體來(lái)源于不同種屬（首選）雙重或多重免疫組織化學(xué)染色的基本方法是用兩種或多種不同的標(biāo)記物標(biāo)記抗體后在同一標(biāo)本上同時(shí)或先后原位顯示兩種或多種不同的抗原第41頁(yè)/共54頁(yè)七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重或多重免疫熒光染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來(lái)源于相同種屬交叉反應(yīng)示意圖如不進(jìn)行交叉反應(yīng)封閉處理，將識(shí)別A抗原的免疫熒光反應(yīng)和顯示B抗原的免疫熒光反應(yīng)分兩步進(jìn)行，那么第二種第一抗體會(huì)與第一種第二抗體結(jié)合，后一種第二抗體既與后一種第一抗體結(jié)合又與前一種第一抗體結(jié)合，以此類推，結(jié)果會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)第42頁(yè)/共54頁(yè)七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重或多重免疫熒光染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來(lái)源于相同種屬***為防止這種交叉反應(yīng)，必須在前一重染色時(shí)或染色后進(jìn)行交叉反應(yīng)阻斷處理，然后進(jìn)行下一重染色。常用的阻斷交叉反應(yīng)的方法有第一抗體種屬轉(zhuǎn)化法和正常血清-單價(jià)Fab片段兩步阻斷法兩種。第一抗體種屬轉(zhuǎn)化法A，小鼠抗A抗原抗體（第一種第一抗體）與抗原A結(jié)合；B，未標(biāo)記的驢抗小鼠IgG單價(jià)Fab片段與第一種第一抗體結(jié)合；C，紅色熒光素標(biāo)記的羊抗未標(biāo)記Fab片段抗體與結(jié)合在第一種第一抗體上的未標(biāo)記單價(jià)Fab片段結(jié)合；D，小鼠抗B抗原抗體（第二種第一抗體）與B抗原結(jié)合；E，綠色熒光素標(biāo)記的的羊抗小鼠抗體（第二種第二抗體）只與第二種第一抗體結(jié)合第43頁(yè)/共54頁(yè)七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重免疫熒光染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來(lái)源于相同種屬***為防止這種交叉反應(yīng)，必須在前一重染色時(shí)或染色后進(jìn)行交叉反應(yīng)阻斷處理，然后進(jìn)行下一重染色。常用的阻斷交叉反應(yīng)的方法有第一抗體種屬轉(zhuǎn)化法和正常血清-單價(jià)Fab片段兩步阻斷法兩種。正常血清-單價(jià)Fab片段兩步阻斷法A，紅色熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠抗體（第一種第二抗體）與結(jié)合在A抗原上的小鼠抗A抗原抗體（第一種第一抗體）結(jié)合；B，小鼠正常血清IgG封閉第一種第二抗體未結(jié)合的Fab片段；C，未標(biāo)記抗小鼠IgG單價(jià)Fab片段封閉第一種第一抗體和小鼠正常血清IgGFc段；D，綠色熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠抗體（第二種第二抗體）只與第二種第一抗體的Fc段結(jié)合第44頁(yè)/共54頁(yè)七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重免疫酶染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來(lái)源于不同種屬雙重免疫酶組織化學(xué)染色先以不同酶標(biāo)記的抗體按照免疫學(xué)原理與相應(yīng)抗原結(jié)合，然后應(yīng)用酶組織化學(xué)原理，以結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的酶催化不同底物呈現(xiàn)不同顏色產(chǎn)物，顯示同一標(biāo)本內(nèi)兩種或多種抗原單酶雙底物法：該方法采用同一種酶標(biāo)記兩種不同的第二抗體，在用兩種第一抗體混合物同時(shí)孵育標(biāo)本后，先用酶（如HRP）標(biāo)記的第一種第二抗體孵育標(biāo)本，與其中的第一種第一抗體結(jié)合，用相應(yīng)的酶底物（如H2O2/DAB）反應(yīng)形成一種顏色的反應(yīng)產(chǎn)物（如棕褐色）以顯示第一種抗原，繼而用同一種酶標(biāo)記的第二種第二抗體孵育標(biāo)本，與其中的第二種第一抗體結(jié)合，用另一種酶底物（如H2O2/4-CN）反應(yīng)形成另一種顏色的反應(yīng)產(chǎn)物（如藍(lán)色）以顯示另一種抗原。第45頁(yè)/共54頁(yè)七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)雙重免疫酶染色（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來(lái)源于不同種屬雙酶雙底物法（PAP法與APAAP法）：該方法采用兩種不同酶（如HRP和AP）分別標(biāo)記兩種不同的第二抗體，在用兩種第一抗體混合孵育標(biāo)本后，繼而用兩種標(biāo)記不同酶的第二抗體混合孵育標(biāo)本，然后用兩種不同酶的底物（如H2O2/DAB和磷酸萘酚/快藍(lán)或BCIP/NBT）先后反應(yīng)，以此形成不同顏色（如棕褐色和藍(lán)色）的反應(yīng)產(chǎn)物。由于兩種第一抗體和第二抗體均可混合后同時(shí)孵育標(biāo)本，因此，雙酶雙底物法較單酶雙底物法簡(jiǎn)便、省時(shí)第46頁(yè)/共54頁(yè)七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法間接法---兩種第一抗體來(lái)源于不同種屬雙酶雙底物法：用兩種生物素化的第二抗體代替雙酶雙底物法中的兩種酶標(biāo)記第二抗體，分別用親和素-HRP-H2O2/DAB顯色系統(tǒng)和AP-磷酸萘酚/快藍(lán)或BCIP/NBT顯色系統(tǒng)顯示兩種不同的抗原。過(guò)程較繁瑣，但敏感度較高雙重親和免疫組織化學(xué)染色第47頁(yè)/共54頁(yè)七、雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)（1）雙重或多重免疫組織化學(xué)基本方法混合型雙重或多重免疫組織化學(xué)染色是指將兩種或多種不同類型的標(biāo)記物結(jié)合進(jìn)行的雙重或多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，如將酶標(biāo)記與熒光素標(biāo)記結(jié)合、膠體金（銀）標(biāo)記與酶標(biāo)記結(jié)合等。在光鏡水平，這種混合法較少用，而在