生物化學(xué)-第三章核酸化學(xué)

生物化學(xué)-第三章核酸化學(xué)第1頁/共68頁1.核酸的化學(xué)組成結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)

2.核酸的測定方法

3.核酸的研究技術(shù)重點(diǎn)：1.RNA.DNA一級結(jié)構(gòu)的測定原理與方法

2.雙螺旋結(jié)構(gòu)要點(diǎn)，三葉草結(jié)構(gòu)要點(diǎn)

3.核酸研究的常用技術(shù)及應(yīng)用

4.核酸含量的測定原理與方法難點(diǎn)：1.DNA一級結(jié)構(gòu)測定的原理與方法

2.核苷酸的兩性離解

3.雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)教學(xué)目的第2頁/共68頁1868年，F(xiàn).Miescher從細(xì)胞核中分離得到一種酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為核酸的物質(zhì)。and可分離第3頁/共68頁核酸的種類和分布核酸分為兩大類：脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）98％核中（染色體）真核線粒體（mtDNA）核外質(zhì)粒（plasmid）葉綠體（ctDNA）DNA擬核原核核外：質(zhì)粒（plasmid）病毒：DNA病毒第4頁/共68頁mRNA(5%)

真核tRNA(10-15%)rRNA（80%）SnRNA(核內(nèi)）

sRNASnoRNA(核仁）RNAmRNAScRNA(胞內(nèi))

原核tRNArRNA

病毒：RNA病毒第5頁/共68頁核酸的功能1、DNA是遺傳信息的載體2、RNA的功能參與遺傳與進(jìn)化參與蛋白質(zhì)的生物合成參與RNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾參與基因表達(dá)調(diào)節(jié)催化等第6頁/共68頁第一節(jié)核酸的組成成分一.元素組成CHONP(9%-9.9%)核酸核苷酸核苷磷酸堿基戊糖嘌呤嘧啶核糖脫氧核糖核酸酶核苷酸酶核苷酶鳥嘌呤腺嘌呤尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶RNA:P-9%,DNA:P-9.9%核酸的組成單位：核苷酸核酸的組成成分：堿基，戊糖，磷酸二.組成成分及組成單位第7頁/共68頁

（一）、戊糖組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為β-D-核糖。RiboseDeoxyribose第8頁/共68頁（二）、堿基1.嘌呤（Purine）堿123456978腺嘌AdenineA鳥嘌呤guanineG嘌呤（Purine）第9頁/共68頁2.嘧啶（Pyrimidine）堿嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶uracilU胞嘧啶CytidineCTH3C胸腺嘧啶Thy第10頁/共68頁(三)、核苷（nucleoside）核苷戊糖+堿基糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)第11頁/共68頁腺嘌呤脫氧核苷鳥嘌呤脫氧核苷胸腺嘧啶脫氧核苷胞嘧啶脫氧核苷HHHHCH3第12頁/共68頁（四）、核苷酸（nucleotide）H第13頁/共68頁（五）.核苷酸衍生物1.繼續(xù)磷酸化AMPADPATP第14頁/共68頁核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。2.稀有堿基1’2’3’4’5’OHOHNH2CH3+7-甲基鳥苷m7G取代核苷的表示方式第15頁/共68頁5OH假尿苷（ψ）次黃苷（肌苷）I黃嘌呤核苷X二氫尿嘧啶核苷D1’2’3’4’5’OHOHOH1’2’3’4’5’OHOH1’2’3’4’5’OHOHOH第16頁/共68頁3.環(huán)化磷酸化

cAMP

cGMP第17頁/共68頁4.肌苷酸及鳥苷酸(強(qiáng)力味精)IMPGMP第18頁/共68頁第二節(jié)、RNA的分子結(jié)構(gòu)一、RNA的一級結(jié)構(gòu)（一）連接方式5’5’3’3’第19頁/共68頁第20頁/共68頁5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′

或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′

ACGTGCGTACGUAUGUT5’3’OHU5’3’OH5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羥基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個多聚核苷酸鏈時，必須注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。多聚核苷酸的表示方式DNARNA第21頁/共68頁(二)、RNA的降解1、RNA的化學(xué)降解堿降解：RNA用稀堿降解產(chǎn)物為2’-核苷酸和3’-核苷酸混合物。DNA抗堿(高溫不抗堿)酸降解：水解速度糖苷鍵>脂鍵嘌呤糖苷鍵>嘧啶糖苷鍵脫氧核糖糖苷鍵>核糖糖苷鍵

在低溫的酸性條件下DNA，RNA則穩(wěn)定第22頁/共68頁2.酶法降解核酸酶有:外切酶，內(nèi)切酶和磷酸酯酶

牛胰RNaseI產(chǎn)物：3’-嘧啶核苷酸（結(jié)尾）內(nèi)切酶RNaseT1

產(chǎn)物：3’-鳥嘌呤核苷酸（結(jié)尾）

RNaseU2

產(chǎn)物：3’-嘌呤核苷酸（結(jié)尾）

SPDase(牛脾)5’-端開始，產(chǎn)物：3’-核苷酸外切酶

VPDase(蛇毒)3’-端開始，產(chǎn)物：5’-核苷酸磷酸單酯酶（PNase）5’-磷酸第23頁/共68頁（一）RNA的二級結(jié)構(gòu)二.RNA的高級結(jié)構(gòu)占RNA總量的15％一種氨基酸對應(yīng)最少一種RNA分子量25000左右，大約由70－90個核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左右。分子中含有較多的修飾成分。3'-末端都具有CpCpAOH的結(jié)構(gòu)。1.特點(diǎn)2.三葉草結(jié)構(gòu)要點(diǎn)第24頁/共68頁（二）tRNA的三級結(jié)構(gòu)第25頁/共68頁第26頁/共68頁第三節(jié)DNA的分子結(jié)構(gòu)一、DNA的一級結(jié)構(gòu)及測定1.加減法ATGCTG3’5’5’3’ATGCTG3’5’5’TACGACTACGATACTACGTATDNA聚合酶4種dNTP(一種為α-32P-標(biāo)記）模板引物第27頁/共68頁ATGCTG3’5’5’TACGACTACGATACTACGTAT+A-T-C-G-A+T+C+GTACGATATACGTACGACTACTTACGTTACTACGATA+A+G+C-G+T-A-C-T電泳方向讀帶方向新合成鏈的5’3’第28頁/共68頁2.雙脫氧法ATGCTG3’5’5’3’DNA聚合酶4種dNTP(一種為α-32P-標(biāo)記）+ddATP+ddTTP+ddCTP+ddGTPTACGddATddATACGAddCTAddCTACddGddT3’TACGACTACGATACTACGTAT+ddA+ddT+ddC+ddGdNTP﹕ddNTP的比例最好為1﹕100

第29頁/共68頁3.化學(xué)修飾法修飾及斷裂條件堿基修飾試劑斷裂條件A+GGT+CC甲酸硫酸二甲酯肼肼+鹽哌啶加熱哌啶哌啶第30頁/共68頁被測定鏈的5’3’第31頁/共68頁二.DNA的二級結(jié)構(gòu)2.0nm小溝大溝要點(diǎn)：1.多核苷酸鏈的走向2.螺旋的角度.高度.直徑3.堿基分布及配對規(guī)律4.作用力（一）雙螺旋提出的基礎(chǔ)（二）雙螺旋結(jié)構(gòu)要點(diǎn)第32頁/共68頁第33頁/共68頁雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù)類型旋轉(zhuǎn)方向結(jié)晶狀態(tài)螺旋直徑（nm）螺距（nm）每轉(zhuǎn)堿基對數(shù)目堿基對間垂直距離（nm）堿基旋轉(zhuǎn)角度A－DNAB－DNAC-DNAz－DNA右75%Na+右92%Na+右66%Li+左人工合成2.02.31.921.82.83.43.14.511109.3120.2550.340.330.2732.7o36o38o-60o（三）雙螺旋的結(jié)構(gòu)類型第34頁/共68頁

（四）左旋DNA—Z-DNA要點(diǎn)1.左旋鋸齒狀2.堿基向外3.只有小溝4.12bp，4.56nm第35頁/共68頁（五）.絞鏈DNA（hing-DNA即H-DNA要點(diǎn)：1.三聯(lián)體堿基配對方式2.第三鏈位于大溝中3.兩條鏈反平行排列4.酸性PH或負(fù)超螺旋張力下

B-DNAH-DNA第36頁/共68頁第37頁/共68頁三、DNA的三級結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋的進(jìn)一步扭曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)。

正超螺旋負(fù)超螺旋雙鏈線性DNA（dsDNA）如真核生物雙鏈環(huán)狀DNA（dcDNA）如細(xì)菌、質(zhì)粒單鏈環(huán)狀DNA（scDNA）如病毒、噬菌體單鏈線性DNA（ssDNA）如病毒、噬菌體第38頁/共68頁連環(huán)數(shù)（linkingnumber）：在雙螺旋DNA中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù).以“L”表示。超螺旋數(shù)或纏繞數(shù)（writhingnumber）：右手超螺旋為正，左手超螺旋為負(fù)。以“W”表示。扭轉(zhuǎn)數(shù)（twstingnumber）：DNA分子中的雙螺旋數(shù)。以“T”表示。L=T+W第39頁/共68頁第四節(jié)核酸及核苷酸的性質(zhì)一、溶解性DNA在PH4.2時溶解度最低。RNA在PH2-2.5時溶解度最低。1.水溶性微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑,水中溶解度DNA達(dá)2%，RNA達(dá)4%2.鹽溶性DNA-蛋白，溶于1mol/LNacl，低鹽不溶。

RNA-蛋白，溶于0.14mol/LNacl，高鹽不溶。3.不同PH的溶解性第40頁/共68頁二.兩性性質(zhì)1.腺嘌呤2.鳥嘌呤:第41頁/共68頁4.尿嘧啶胸腺嘧啶3.胞嘧啶第42頁/共68頁第43頁/共68頁三、核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。以A260/A280進(jìn)行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光第44頁/共68頁四、核酸的變性與復(fù)性（一）.變性變性:穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。變性表征:

生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）變性因素:

pH（>11.3或<5.0）變性劑（脲、甲酰胺、甲醛），低離子強(qiáng)度加熱第45頁/共68頁第46頁/共68頁熱變性和Tm:DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時的溫度稱熔解溫度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通過經(jīng)驗(yàn)公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)*2.44第47頁/共68頁（二）.核酸的復(fù)性變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時可復(fù)性，因此又稱為“退火”。退火溫度＝Tm－25℃復(fù)性影響因素片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/純度/溶液離子強(qiáng)度第48頁/共68頁（三）.核酸的復(fù)性與分子雜交Δ退火復(fù)性雜交變性兩個不同來源的DNA分子第49頁/共68頁第五節(jié)核酸及其組分的分離純化與測定一.分離純化的一般原則1.防止核酸酶降解2.防止化學(xué)因素降解3.防止物理因素降解二.DNA的分離純化三.RNA的分離純化四.核酸組分的分離純化第50頁/共68頁

破細(xì)胞（1mol/LNaCL）

離心去沉淀（含RNA-Pr）上清（含DNA-Pr）

SDS法/酚法（去蛋白）離心去沉淀（變性蛋白）上清（含DNA）乙醇沉淀離心收集沉淀（DNA）

細(xì)胞（飽和酚處理）離心去沉淀（含DNA-Pr）上清液調(diào)節(jié)PI（RNAPI）離心去上清收集沉淀（總RNA）不同的RNA分離時可用：

DEAE-Sephadex

超離心

Olig-dt親和層析第51頁/共68頁1.離子交換法：四種核苷酸之間的分離采用離子交換法陽離子交換劑洗脫次序：理論次序

UGAC實(shí)際次序UGCA陰離子交換劑洗脫次序：理論次序CAGU實(shí)際次序CAUG第52頁/共68頁2.凝膠過濾法:堿基,核苷,核苷酸之間的分離采用Sephadex-G10/G25洗脫次序：核苷酸核苷堿基核苷一磷酸,核苷二磷酸,核苷三磷酸的分離采用柱層析和薄層層析法分離.

柱層析洗脫次序AMPADPATP

薄層層析遷移次序AMPADPATP3.DEAE-纖維素法:第53頁/共68頁

五.核酸及其組分含量的測定與純度測定（一）.核酸含量的測定方法1.紫外吸收法1ug/mlDNAA260=0.021A260=50Ug/mlDNA1ug/mlRNAA260=0.022-0.0241A260=40Ug/mlRNA2.定糖法(20-250ugRNA,40-400ugDNA)苔黑酚法：苔黑酚+核糖+濃HCl+FeCl3

綠色A670-680二苯胺法：二苯胺+脫氧核糖+濃H2SO4

藍(lán)色A595-6203.定磷法(10-100ug核酸)4.凝膠電泳EB(0.5ug/ml)染色,最小檢出量1ngVitCH3PO4+鉬酸銨黃色磷鉬酸銨磷鉬藍(lán)A650-660第54頁/共68頁（二）.核酸純度的測定1.紫外吸收法測定A260與A280A260A280=1.8-2.0DNA:2.凝膠電泳3.等密度梯度離心≥2.0RNA:A260A280第55頁/共68頁凝膠電泳等密度梯度離心第56頁/共68頁第六節(jié)核酸研究的常用技術(shù)一.DNA的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖凝膠濃度及選擇2.瓊脂糖凝膠電泳的分辨率3.瓊脂糖凝膠電泳的用途(分離,測量,回收,印跡)（二）PAGE電泳1.PAGE濃度及選擇2.PAGE電泳的分辨率3.PAGE電泳的用途（三）影響凝膠電泳Rf值的因素1.分子大小2.分子構(gòu)象3.凝膠濃度4.電流電壓5.溫度第57頁/共68頁二.印跡技術(shù)與分子雜交（一）.印跡技術(shù)概念:核酸的雜交中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA/RNA分子，雜交之前通過毛細(xì)管吸附作用/電導(dǎo)作用將凝膠中DNA/RNA分子原封不動地轉(zhuǎn)移到濾膜上。濾膜:硝酸纖維素濾膜，DEAE-纖維素濾膜印跡種類:Southernblotting:（1975）Northernblotting:（1979，Alwine)（1979，Towbin,Immunoblotting-Western;198