酶的生物合成

第1頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三生物體內(nèi)酶合成的過程稱為酶的生物合成。利用微生物代謝活動生產(chǎn)所需酶的過程，稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。第2頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三微生物酶的開發(fā)應用：(1)微生物生長繁殖快，生活周期短。因此，用微生物來生產(chǎn)酶產(chǎn)品，生產(chǎn)能力（發(fā)酵）幾乎可以不受限制地擴大，能夠滿足迅速擴張的市場需求。(2)微生物種類繁多，它們散布于整個地球的各個角落，而且在不同的環(huán)境下生存的微生物都有其完全不同的代謝方式，能分解利用不同的底物。(3)這一特征就為微生物酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎。(4)特別是當基因工程介入時，動植物細胞中存在的酶，幾乎都能夠利用微生物細胞獲得。

因此，有計劃和仔細地篩選微生物菌種，通?？梢垣@得能夠生產(chǎn)幾乎任何一種酶的適當細胞。第3頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)酶發(fā)酵生產(chǎn)用微生物菌種微生物菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的首要條件。目前投入工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶的菌種包括細菌、放線菌、酵母菌、霉菌等。第4頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第5頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三一、酶發(fā)酵生產(chǎn)用菌種的要求產(chǎn)酶量高，具有生產(chǎn)應用價值；易培養(yǎng)，即能適應大生產(chǎn)粗放的營養(yǎng)和培養(yǎng)條件，包括廉價原料，對工藝條件要求不苛刻；代謝速率高，發(fā)酵周期短；產(chǎn)酶穩(wěn)定性好，菌種的生產(chǎn)性能不易退化，不易感染噬菌體；安全可靠，要求菌種不是致病菌，其代謝安全無毒，在系統(tǒng)發(fā)育樹上最好與病原體無關；選用產(chǎn)胞外酶的菌種，有利于酶的分離提取。第6頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三二、微生物產(chǎn)酶菌株的獲得從土壤以及發(fā)酵生產(chǎn)材料中分離；菌種保存中心。第7頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三1、含菌樣品的采集

采樣的目的、采樣地點、采樣方法及采樣的數(shù)量。若預先不了解某種產(chǎn)酶微生物的具體來源，一般可從土壤分離。產(chǎn)纖維素產(chǎn)脂肪酶產(chǎn)果膠酶產(chǎn)糖化酶第8頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、菌種的分離純化劃線分離法稀釋分離法第9頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3.菌種的初篩第10頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三4.菌種的復篩5.產(chǎn)酶最佳條件的確定第11頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三6.微生物產(chǎn)酶性能的進一步提高經(jīng)誘變獲得高產(chǎn)菌種突變體利用代謝工程和代謝調(diào)節(jié)機理來提高微生物的酶產(chǎn)量。運用遺傳工程、基因工程的手段將原有菌株中的目的基因轉(zhuǎn)移到另外一些對生產(chǎn)環(huán)境適應性更強的微生物細胞內(nèi)，使其高效表達。第12頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三7.微生物產(chǎn)酶菌種的保藏斜面保藏沙土管保藏冷凍保藏第13頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)發(fā)酵工藝條件及控制一、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分培養(yǎng)基是指人工配制的用于細胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。在設計和配制培養(yǎng)基時，應特別注意各種組分的種類和含量，以滿足細胞生長、繁殖和新陳代謝的需要，并要調(diào)節(jié)至適宜的pH。還必須注意到，有些細胞生長、繁殖階段和發(fā)酵階段所要求的培養(yǎng)基有所不同，在此情況下，要根據(jù)需要配制不同的生長培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。第14頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三1．碳源碳源是指能夠向細胞提供碳素化合物的營養(yǎng)物質(zhì)。通常碳源同時也是提供能量的能源。碳是構成細胞成分的主要元素之一，也是各種酶的重要組成元素。所以，碳源是酶發(fā)酵生產(chǎn)乃至其他產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)的必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)。目前，在酶發(fā)酵生產(chǎn)中最常用的碳源是淀粉及其水解物，如糊精、麥芽糖、葡萄糖等。第15頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三不同的細胞對各種碳源的利用情況大不相同，所以在配制培養(yǎng)基時應根據(jù)不同細胞的不同要求而選擇適宜的碳源。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，除了要從營養(yǎng)的角度考慮碳源的選擇以外，還要考慮到碳源對酶生物合成的調(diào)節(jié)作用，主要要考慮酶生物合成的誘導作用以及是否存在分解代謝物作用。在選擇碳源時應盡量選用對所需的酶有誘導作用的碳源，而不使用或少使用有分解代謝物阻遏作用的碳源。例如，α-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應選用對該酶有誘導作用的淀粉作為碳源，而不用對該酶的生物合成有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。β-半乳糖苷酶發(fā)酵應選用乳糖為碳源，而不用或少用葡萄糖為碳源等等。在選擇碳源時，必需考慮原料的供求和價格問題。第16頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2．氮源氮是組成細胞蛋白質(zhì)和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要組成元素。凡能夠向細胞提供氮源素的營養(yǎng)物質(zhì)稱為氮源。氮源可分為有機氮源和無機氮源兩種。有機氮源主要是各種蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物。如：酪蛋白、豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、多肽、氨基酸等。無機氮源是含氮的各種無機化合物，如硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉等各種銨鹽和硝酸鹽等。第17頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三不同的細胞對各種氮源的要求各不相同，應根據(jù)要求進行選擇和配制。一般說來，動物細胞要求有機氮，植物細胞主要要求無機氮，微生物細胞中，異養(yǎng)型微生物用有機氮，自養(yǎng)型微生物用無機氮。碳和氮兩者的比例對酶的產(chǎn)量有顯著的影響。所謂碳氮比（C/N）一般是指培養(yǎng)基中碳元素（C）的總量與氮元素（N）總量之比?？赏ㄟ^測定或計算培養(yǎng)基中碳和氮的含量而求出。有的氮源及其濃度如氨基酸的變化對酶發(fā)酵有代謝調(diào)節(jié)作用。第18頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3．無機鹽無機鹽的主要作用是提供細胞生命活動不可缺少的無機元素，并對培養(yǎng)基的PH、氧化還原電位和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。根據(jù)細胞對無機元素需要量的大小，可分為主要元素（大量元素）和微量元素兩大類。主要元素有：磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣等。微量元素有：銅、錳、鋅、鉬、鈷、碘等。微量元素是細胞生命活動不可缺少的，但需要量很少，過量反而會引起不良效果，必須嚴加控制。

第19頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三各種無機元素的功用各不相同，有些是細胞的主要組分，如：磷、硫等；有些是酶的組分，如：磷、硫、鋅、鈣等；有些是酶的激活劑或抑制劑，如：鉀、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鈣、鉬、鈷、氯、溴、碘等；有些則是對pH、滲透壓、氧化還原電位起調(diào)節(jié)作用的，如：鈉、鉀、鈣、氯、磷等。其中磷是特別重要的元素，它是構成核酸和磷脂的成分。微量元素有的是某些酶的組成成分，有的是酶的激活劑，也有的是輔酶的必需成分。第20頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三4．生長因子生長因素是指細胞生長繁殖所必不可缺的微量有機化合物主要包括各種氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素，以及動植物生長激素等。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，通常在培養(yǎng)基中加進玉米漿、酵母膏等天然原料。其中玉米漿最常用。第21頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三5、產(chǎn)酶促進劑

在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進劑。誘導物表面活性劑

表面活性劑能夠增加細胞透性，其處在氣-液界面改善了氧的傳遞速度，還可以保護酶的活性，另外還可消泡提高氧傳遞系數(shù)。第22頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三二、發(fā)酵條件的控制及對產(chǎn)酶的影響1、溫度枯草桿菌的最適生長溫度為34～37℃黑曲霉的最適生長溫度為28～32℃通常在生物學范圍內(nèi)每升高10℃，生長速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應，對于微生物來說，溫度直接影響其生長和合成酶。第23頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三有些細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與細胞生長最適溫度有所不同，而且往往低于生長最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對應的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時間，從而提高酶的產(chǎn)量。有些酶的發(fā)酵生產(chǎn)，要在不同階段控制不同的溫度條件。在生長繁殖階段控制在細胞生長最適溫度范圍內(nèi)，以利于細胞生長繁殖，而在產(chǎn)酶階段，則需控制在產(chǎn)酶的最適溫度。第24頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三在細胞生長和發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，由于細胞的新陳代謝作用，不斷放出熱量，會使培養(yǎng)基的溫度升高，同時，熱量不斷擴散和散失，又會使培養(yǎng)基溫度降低，兩者綜合，決定了培養(yǎng)基的溫度。由于在發(fā)酵的不同階段，細胞新陳代謝放出的熱量差別很大，擴散和散失的熱量受到環(huán)境溫度等因素的影響，使培養(yǎng)基的溫度變化明顯。為此必須經(jīng)常及時地進行調(diào)節(jié)控制，使培養(yǎng)基的溫度經(jīng)常維持在適宜的范圍內(nèi)。溫度控制的方法一般采用熱水升溫，冷水降溫，故此在發(fā)酵罐中，均設計有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等。第25頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、pH值pH影響微生物體內(nèi)各種酶的活性，從而導致微生物的代謝途徑發(fā)生改變。影響微生物形態(tài)和細胞膜的透性，從而影響微生物對培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。影響培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物質(zhì)的分解或中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用。第26頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三不同細胞生長繁殖的最適pH有所不同。一般細胞和放線菌的生長最適pH為中性或微堿性（pH6.5～8.0）；霉菌和酵母的生長最適pH為偏酸性（PH4.0～6.0）；植物細胞生長的最適pH為5～6。有些細胞可以同時產(chǎn)生多種酶，通過控制培養(yǎng)基的PH，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。例如：黑曲霉可生產(chǎn)α—淀粉酶，又可生產(chǎn)糖化酶。當培養(yǎng)基的PH偏向中性時，可使α—淀粉酶產(chǎn)量增加而糖化酶減少，反之，當培養(yǎng)基的PH偏向酸性時，則糖化酶產(chǎn)量提高而α—淀粉酶的量降低。再如用米曲霉生產(chǎn)蛋白酶，當培養(yǎng)基的PH為堿性時，主要生產(chǎn)堿性蛋白酶，降低培養(yǎng)基的PH，則主要生產(chǎn)中性或酸性蛋白酶。第27頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三

培養(yǎng)基的pH在細胞生長繁殖和代謝物產(chǎn)生的過程中往往會發(fā)生變化。這種變化與細胞特性有關，也與培養(yǎng)基的組分密切相關。含糖量高的培養(yǎng)基，由于糖代謝產(chǎn)生有機酸，會使培養(yǎng)基的pH向酸性方向移動；含蛋白質(zhì)、氨基酸較多的培養(yǎng)基，經(jīng)代謝產(chǎn)生較多的胺類物質(zhì)，使pH向堿性方向移動；以硫酸銨為氮源時，隨著銨離子被細胞利用，使培養(yǎng)基pH下降；以尿素為氮源時，先隨著尿素被脲酶水解生成氨，使培養(yǎng)基pH上升，然后又隨著氨被細胞同化而使PH下降；磷酸鹽的存在，對培養(yǎng)基的pH起一定的緩沖作用。所以在細胞培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，必須對培養(yǎng)基的pH進行適當?shù)目刂坪驼{(diào)節(jié)。PH的調(diào)節(jié)可以通過改變培養(yǎng)基的組分或其比例來實現(xiàn)。必要時可使用緩沖溶液，或流加適宜的酸、堿溶液，以調(diào)節(jié)控制培養(yǎng)基中pH變化。第28頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三生產(chǎn)上對pH的控制和調(diào)節(jié)的方法：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值，控制合適的C/N，調(diào)整生理酸性物質(zhì)與生理堿性物質(zhì)之間的比例。補料調(diào)節(jié)，即通過發(fā)酵過程中流加碳源、氮源來調(diào)節(jié)pH值添加緩沖液，維持一定的pH值如pH值變化較大，可直接加酸或堿進行調(diào)節(jié)。通過對溶解氧的調(diào)節(jié)，來控制中間代謝產(chǎn)物的氧化程度。第29頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3、溶解氧的控制培養(yǎng)液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質(zhì)等有密切關系。一般說來，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時間越長、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養(yǎng)液的性質(zhì)，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對于溶氧速率有明顯影響。調(diào)節(jié)通氣量調(diào)節(jié)氧的分壓調(diào)節(jié)氣液接觸時間調(diào)節(jié)氣液接觸面積改變培養(yǎng)液的性質(zhì)

控制溶解氧方法第30頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三三、固定化微生物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及其控制固定化細胞又稱固定化活細胞或固定化增殖細胞，是指用各種方法固定在載體上又能進行生長、繁殖和新陳代謝的細胞。1、固定化細胞的預培養(yǎng)固定化細胞制備好以后，一般要進行預培養(yǎng)，以使固定在載體上的細胞生長繁殖。待長好后，才用于發(fā)酵產(chǎn)酶。為了使固定化細胞生長良好，預培養(yǎng)應采用利于生長的生長培養(yǎng)基和工藝條件。然后改換成有利于產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵工藝條件。有時也可采用相同的培養(yǎng)基和工藝條件進行預培養(yǎng)和發(fā)酵。第31頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、溶解氧的供給固定化細胞在進行培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，由于受到載體的影響，氧的溶解和傳遞受到一定的阻礙作用。特別是采用包埋法制備的固定化細胞，氧要通過凝膠層擴散到凝膠粒內(nèi)部，才能供細胞應用，使氧的供給成為主要的限制性因素。為此，必須增加溶解氧的量，才能滿足細胞生長和產(chǎn)酶的需要。由于固定化細胞反映器均不能采用強烈的攪拌，以免破壞固定化細胞，所以，增加溶解氧的主要方法是加大通氣量。例如，游離的枯草桿菌細胞發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶，通氣量一般控制在0.5∽1m3/(m3.min),而采用固定化細胞發(fā)酵，其通氣量要1∽2m3/(m3.min),或者更多。第32頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三

此外，可通過改變固定化載體，固定化技術或改變培養(yǎng)基組分等方法，以改善供氧。例如，瓊脂對氧的擴散不利，應盡量少用作固定化載體；在凝膠中加進某些物質(zhì)，使其有利于氧的傳遞；采用過氧化氫酶與細胞共固定化，再在培養(yǎng)液中添加適量的過氧化氫，通過酶的作用，產(chǎn)生氧氣，共細胞使用；降低培養(yǎng)基的濃度，盡量降低培養(yǎng)基的粘度等。溶解氧的供給，是固定化細胞好氣性發(fā)酵的關鍵限制性因素之一。有待進一步研究解決。第33頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3.溫度的控制

固定化細胞對溫度的適應范圍較廣，在分批發(fā)酵和半連續(xù)發(fā)酵中，溫度不難控制。但在連續(xù)發(fā)酵過程中，由于稀釋率較高，反應器內(nèi)溫度變化較大。若只是在反應器內(nèi)調(diào)節(jié)溫度，則在流加的培養(yǎng)液溫度差別較大時，難以達到要求。一般在培養(yǎng)液進入反應器之前，必須預先調(diào)節(jié)到適宜溫度。第34頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三4．培養(yǎng)基成分的控制培養(yǎng)基的濃度不宜過高，并可以通過改變培養(yǎng)基組分來降低培養(yǎng)基的黏度，有利于氧的溶解和擴散，從而克服固定化細胞好氧發(fā)酵過程中氧溶解和傳遞的限制。培養(yǎng)基的組分不能影響固定化細胞的穩(wěn)定性，或影響很小。第35頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三四、固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及其控制1、培養(yǎng)基滲透壓的控制2、控制培養(yǎng)基組分、防止細胞壁再生3、維持較高的原生質(zhì)體濃度第36頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)提高酶產(chǎn)量的方法一、酶生物合成的調(diào)控機制Reversetranscription第37頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三操縱子（operon）：是一組功能上相關，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個遺傳單位。第38頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三根據(jù)基因調(diào)節(jié)控制理論，在DNA分子中，與酶生物合成有密切關系的基因有4種。它們是調(diào)節(jié)基因(Regulatorgene)、啟動基因(Promotergene)、操縱基因(Operatorgene)和結構基因(Struturalgene)。第39頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三結構基因是編碼蛋白的基因，它與多肽鏈有對應關系。操縱基因在操縱子中起“開關”作用，它可以與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的別構蛋白（阻遏蛋白）中的一種結構結合，從而操縱酶生物合成的時機和合成速度。啟動基因有兩個位點組成，一個是RNA聚合酶的結合位點，另一個是環(huán)腺苷酸（cAMP）與環(huán)腺苷酸接受蛋白（CRP）的復合物（cAMP-CRP）的結合位點。只有在cAMP-CRP復合物結合到啟動基因的位點上時，RNA聚合酶才能結合到其在啟動基因的位點上，這樣，酶的合成才有可能開始，否則酶就無法開始合成。調(diào)節(jié)基因編碼調(diào)節(jié)蛋白。第40頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三操縱子的類型誘導型操縱子（inducibleoperon)：在無誘導物的情況下，其基因不表達或表達的水平很低，只有當誘導物存在時，才能進行轉(zhuǎn)錄生成mRNA，進而經(jīng)翻譯合成酶。乳糖操縱子阻遏型操縱子（repressibleoperon）：在無阻遏物情況下，基因正常表達，當有阻遏物存在時，轉(zhuǎn)錄則受阻遏，酶不能合成。色氨酸操縱子此外，啟動基因位點上的cAMP-CAP復合物的結合與否，也對酶的生物合成起調(diào)節(jié)作用。第41頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三基因?qū)γ干锖铣傻恼{(diào)節(jié)控制有3種模式分解代謝物阻遏作用酶合成的誘導作用酶合成的反饋阻遏作用。第42頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三1、酶生物合成的誘導作用加進某種物質(zhì),使酶的生物合成開始或加速進行的過程,稱為酶生物合成的誘導作用。簡稱為誘導作用。起誘導作用的物質(zhì)，稱為誘導劑。第43頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三酶生物合成的誘導作用（A）-無誘導物時（B）-添加誘導物時第44頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、酶生物合成的反饋阻遏作用1.大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時，檢測到細胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

2.在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌生長的經(jīng)濟原則：不需要就不合成。第45頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三某些代謝物可以阻止某些酶的合成，是通過阻止為該酶編碼的基因的表達而進行的，這種現(xiàn)象叫做酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物質(zhì)叫輔阻遏物。被輔阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。第46頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三調(diào)節(jié)基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結合，結構基因表達調(diào)節(jié)基因操縱基因結構基因輔阻遏物trp代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結合，使之構象發(fā)生變化與操縱基因結合，結構基因不能表達色氨酸操縱子（酶的阻遏）

----------阻遏物和操縱基因的調(diào)節(jié)第47頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3、分解代謝阻遏某些物質(zhì)（主要是葡萄糖和其他容易利用的碳源等）分解代謝的產(chǎn)物阻遏某些酶（特別是參與分解代謝的酶）生物合成的現(xiàn)象稱為分解代謝阻遏作用，也稱為葡萄糖效應。分解代謝阻遏作用之所以產(chǎn)生，一是由于葡萄糖的分解代謝引起ATP濃度的上升，消耗胞內(nèi)的環(huán)腺苷酸（cAMP）;二是當葡萄糖等作為唯一碳源時，葡萄糖的降解物對腺苷酸環(huán)化酶活性有抑制作用，降低cAMP的生成。第48頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三細菌乳糖操縱子的作用機制(降解物阻遏)調(diào)節(jié)基因啟動子操縱基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP復合物mRNA當葡萄糖作唯一碳源時，葡萄糖的降解物對腺苷酸環(huán)化酶有抑制作用，則cAMP的濃度降低，CAP-cAMP復合物減少，不能與啟動子結合，故轉(zhuǎn)錄不得進行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透過酶-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶酶過去稱葡萄糖效應本節(jié)目錄第49頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三++++轉(zhuǎn)錄無葡萄糖，cAMP濃度高時促進轉(zhuǎn)錄有葡萄糖，cAMP濃度低時不促進轉(zhuǎn)錄ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAPCAP的正調(diào)控第50頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三乳糖操縱子的啟動基因內(nèi)，除RNA聚合酶結合位點外，還有一個稱為cAMP-CAP復合物的結合位點。cAMP是環(huán)腺苷酸，CAP是降解物基因活化蛋白（又稱cAMP受體蛋白，CRP）當CAP與cAMP結合后，就會被活化。cAMP-CAP復合物又會激活啟動基因，使RNA聚合酶與啟動基因結合。乳糖和葡萄糖同時存在時，因為分解葡萄糖的酶類屬于組成酶，能迅速地將葡萄糖降解成某種中間產(chǎn)物，既會阻止ATP環(huán)化形成cAMP，同時，又會促進cAMP分解AMP，從而降低cAMP的濃度，繼而阻遏了乳糖降解有關的誘導酶合成。第51頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三二、打破酶合成調(diào)節(jié)機制限制及提高酶產(chǎn)量的方法1、通過條件控制提高酶產(chǎn)量（1）添加誘導物誘導物包括：酶的作用底物一些難以代謝的底物類似物酶催化的產(chǎn)物誘導物的前體物質(zhì)同一種酶有多種誘導物誘導和阻遏之間沒有絕對的界限，其關鍵在于濃度第52頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（2）降低阻遏物的濃度產(chǎn)物阻遏作用：由酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。分解代謝阻遏作用：有葡萄糖和其他容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)引起的阻遏作用。第53頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三為了減少或者解除分解代謝阻遏作用，應當控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源濃度。常采取的措施如下：盡量不用葡萄糖等容易被利用的碳源，而采用其他較難利用的碳源。采取補料流加以及分次流加碳源的方法，將碳源的濃度控制在較低的水平。添加一定的cAMP第54頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三對于受產(chǎn)物阻遏作用的酶（酶合成的反饋阻遏作用），可以通過以下措施降低尾產(chǎn)物積累，解除阻遏，從而提高酶合成的產(chǎn)量。在培養(yǎng)基中添加尾產(chǎn)物類似物，避免尾產(chǎn)物大量生成。采用尾產(chǎn)物的營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵生產(chǎn)酶。通過外加該營養(yǎng)物質(zhì)，人為控制其營養(yǎng)物質(zhì)處于亞適量狀態(tài)，避免它對酶合成造成阻遏。直接去尾產(chǎn)物法。在培養(yǎng)基中添加阻止尾產(chǎn)物形成的抑制劑，以減少阻遏物的積累。第55頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、通過基因突變和基因重組提高酶產(chǎn)量通過基因工程提高酶產(chǎn)量的途徑：使誘導型菌株變成組成型菌株使阻遏型菌株變?yōu)槿プ瓒粜途辏棺瓒粜途辏?。通過基因工程的手段增加細胞內(nèi)的基因拷貝數(shù)。第56頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三誘變的方法：物理化學物理和化學的結合第57頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三菌株篩檢（1）組成型突變株篩選將誘變后的產(chǎn)酶菌株在低誘導力的誘導物為主要碳源或氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并同時限制誘導物濃度在一定水平，或同時加入誘導抑制劑，在此條件下增值的為組成型突變株。另外，將誘變后的產(chǎn)酶菌株在含誘導物和不含誘導物的培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)，重復交替培養(yǎng)可獲得突變株。第58頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（2）抗分解代謝產(chǎn)物阻遏型突變株篩檢以被阻遏物的酶的底物為唯一氮源，如產(chǎn)氣氣桿菌誘變后在含有葡萄糖和以組氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)移多代，便得到產(chǎn)組氨酸酶的抗葡萄糖效應的變異株。變異后的產(chǎn)酶菌在含有葡萄糖和不含葡萄糖的培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)。（3）抗尾產(chǎn)物阻遏變異株篩檢可在誘變后的菌株培養(yǎng)基上加入結構上與尾產(chǎn)物類似的毒性抗代謝劑。第59頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3、其他提高酶產(chǎn)量的方法（1）添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓(Triton)等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加。由于離子型表面活性劑對細胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如‘新潔而滅’等）是消毒劑，對細胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。第60頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（2）添加產(chǎn)酶促進劑產(chǎn)酶促進劑是指可以促進產(chǎn)酶、但是作用機理未闡明清楚的物質(zhì)。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1～20倍；添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的產(chǎn)量。產(chǎn)酶促進劑對不同細胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒有規(guī)律可循，要通過試驗確定所添加的產(chǎn)酶促進劑的種類和濃度。第61頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)酶發(fā)酵動力學一、酶生物合成的模式細胞在一定條件下培養(yǎng)生長，其生長過程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長期、平衡期和衰退期等4個階段第62頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第63頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三通過分析比較細胞生長與酶產(chǎn)生的關系,可以把酶生物合成的模式分為4種類型：同步合成型延續(xù)合成型中期合成型滯后合成型第64頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三1、同步合成型

同步合成型：酶的生物合成與細胞生長同步進行的一種酶生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細胞生長速度緊密聯(lián)系，又稱為生長偶聯(lián)型。屬于該合成型的酶，其生物合成伴隨著細胞的生長而開始；在細胞進入旺盛生長期時，酶大量生成；當細胞生長進入平衡期后，酶的合成隨著停止。第65頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細胞濃度活細胞濃度胞外酶濃度胞內(nèi)酶濃度第66頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導酶也按照此種模式進行生物合成。例如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸的培養(yǎng)基中生長，在單寧或沒食子酸的誘導作用下，合成單寧酶。同步合成酶生物合成調(diào)節(jié)的特點：酶的生物合成可以誘導，但是不受分解代謝物的阻遏作用和產(chǎn)物的反饋阻遏作用。該類型酶對應的mRNA很不穩(wěn)定，其壽命一般只有幾十分鐘，在細胞進入生長平衡期后，新的ｍRNA不再生成,在原有的mRNA很快被降解后，酶的生物合成隨即停止。第67頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、延續(xù)合成型酶的生物合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長時間。屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導酶。例如：在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以誘導聚半乳糖醛酸酶的生物合成。

第68頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導物以含有葡萄糖的果膠為誘導物第69頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三該類酶在細胞生長達到平衡期以后，新的mRNA不再生成，但仍可以延續(xù)合成，說明這些酶所對應的mRNA相當穩(wěn)定，在平衡器以后相當長的一段時間內(nèi)仍然可以通過翻譯合成其所對應的酶。當延續(xù)合成型酶的生物合成可以受到分解代謝物阻遏時，在培養(yǎng)基中若沒有阻遏物，則呈現(xiàn)延續(xù)合成型，而在培養(yǎng)基中存在阻遏物時，便成為滯后合成型。第70頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3、中期合成型

中期合成型是同步合成類型中的一種特殊形式。合成特點：該類型的酶在細胞生長一段時間以后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止。代謝調(diào)節(jié)特點：酶的生物合成受到產(chǎn)物的反饋阻遏作用或分解代謝物阻遏作用。第71頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三

枯草桿菌堿性磷酸酶的生物合成模式屬于中期合成型。這是由于該酶的合成受到其反應產(chǎn)物無機磷酸的反饋阻遏，而磷又是細胞生長所必不可缺的營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中必須有磷的存在。這樣，在細胞生長的開始階段,培養(yǎng)基中的磷阻遏堿性磷酸酶的合成，只有當細胞生長一段時間，培養(yǎng)基中的磷幾乎被細胞用完（低于0.01mmol/L）以后，該酶才開始大量生成。又由于堿性磷酸酶所對應的mRNA不穩(wěn)定，其壽命只有30min左右，所以當細胞進入平衡期后，酶的生物合成隨著停止。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml第72頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三4、滯后合成型

此類型酶是在細胞生長一段時間或者進入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯(lián)型。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。屬于滯后合成型的酶，之所以要在細胞生長一段時間甚至進入平衡期以后才開始合成，主要原因是由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細胞的生長，阻遏物幾乎被細胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。第73頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，為了提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，最理想的合成模式應是延續(xù)合成型。因為屬于延續(xù)合成型的酶，在發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細胞一開始生長就有酶產(chǎn)生，直至細胞生長進入平衡期以后，酶還可以繼續(xù)合成一段較長的時間。第74頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三該類型酶所對應的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細胞生長進入平衡期后的相當長的一段時間內(nèi)，繼續(xù)進行酶的生物合成。第75頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三酶所對應的mRNA的穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中阻遏物的存在是影響酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA穩(wěn)定性好的，可以在細胞生長進入平衡期以后，繼續(xù)合成其所對應的酶；mRNA穩(wěn)定性差的，就隨著細胞生長進入平衡期而停止酶的生物合成；不受培養(yǎng)基中存在的某些物質(zhì)阻遏的，可以伴隨著細胞生長而開始酶的合成；受到培養(yǎng)基中某些物質(zhì)阻遏的，則要在細胞生長一段時間甚至在平衡期后，酶才開始合成并大量積累。第76頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三對于其他合成模式的酶，可通過下列措施來改變其合成模型，使其接近延續(xù)合成型：菌種選育工藝參數(shù)的優(yōu)化控制發(fā)酵代謝調(diào)節(jié)第77頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三其中對于同步合成型的酶，要盡量提高其對應的mRNA的穩(wěn)定性，為此適當降低發(fā)酵溫度是可取的措施；對于滯后合成型的酶，要設法降低培養(yǎng)基中阻遏物的濃度，盡量減少甚至解除產(chǎn)物阻遏或分解代謝物阻遏作用，使酶的生物合成提早開始；而對于中期合成型的酶，則要在提高mRNA的穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面下功夫，使其生物合成的開始時間提前，并盡量延遲其生物合成停止的時間。第78頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三二、酶生產(chǎn)過程中細胞生長動力學細胞生長動力學主要研究細胞生長速度以及外界環(huán)境因素對細胞生長速度影響的規(guī)律。1950年，法國的莫諾德(Monod)首先提出了表述微生物細胞生長的動力學方程：rx=rx為細胞生長速率，X為細胞濃度，μ為生長速率假設培養(yǎng)基中只有一種限制性基質(zhì)，而不存在其他生長限制因素時，μ為這種限制性基質(zhì)濃度的函數(shù)。μm是指限制性底物濃度過量時的比生長速率，即當S＞＞Ks時，μ=

μm；KS

為莫諾德常數(shù)，是指比生長速率達到最大比生長速率一半時的限制性基質(zhì)濃度。第79頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三對于游離細胞連續(xù)全混流生物培養(yǎng)的生長動力學方程為：

D為稀釋倍數(shù)，指單位時間內(nèi)劉家的培養(yǎng)液與發(fā)酵容器中培養(yǎng)液體積之比，一般以h-1，稀釋D的大小在0與μm之間。第80頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三當稀釋率小于比生長速率，即D<μ時，細胞生長速率為正值，表明發(fā)酵罐中細胞濃度不斷增加，隨著細胞濃度增加，限制性基質(zhì)的濃度相對降低，從而使細胞生長速率μ減少，在比生長速率降低到與稀釋率相等的時候，重新達到穩(wěn)態(tài)。當稀釋率等于比生長速率，即D=μ，細胞生長速率為0，即在一定體積的培養(yǎng)液中，單位時間內(nèi)流出的細胞與新增值的細胞數(shù)相同，培養(yǎng)液中細胞濃度保持恒定不變，此時的培養(yǎng)達到穩(wěn)態(tài)。第81頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三③當稀釋率等于比生長速率，即D>μ，細胞生長速率為負值，在一定體積的培養(yǎng)液中的濃度不斷被稀釋而逐漸降低，隨著細胞濃度降低，限制性基質(zhì)的相對濃度相對升高，使比生長速率μ增大，在比生長速率升到與稀釋率相同時，重新建立新的平衡，達到穩(wěn)態(tài)。④而當稀釋率大于最大比生長速率，及D>μm，細胞濃度趨向于0，無法建立穩(wěn)態(tài)。第82頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三三、產(chǎn)酶動力學產(chǎn)酶動力學主要研究細胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。產(chǎn)酶動力學的研究可以從整個發(fā)酵系統(tǒng)著眼，研究群體細胞的產(chǎn)酶速率及其影響因素，這稱為宏觀產(chǎn)酶動力學或這稱為非結構動力學。也可以從細胞內(nèi)部著眼，研究細胞中酶合成速率及其影響因素，這謂之微觀產(chǎn)酶動力學或稱為結構動力學。第83頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三宏觀產(chǎn)酶動力學的研究表明，產(chǎn)酶速率與細胞比生長速率、細胞濃度及細胞產(chǎn)酶模式有關。產(chǎn)酶動力學模型或產(chǎn)酶動力學方程可以表示為：α是與生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)，以每克干細胞產(chǎn)酶的單位數(shù)表示，U/g；β為非生長偶聯(lián)的產(chǎn)酶速率，以小時每克干細胞產(chǎn)酶的單位數(shù)來表示，U/（h.g)；E為酶濃度，以每升發(fā)酵液中所含的酶單位數(shù)表示，U/L；t為時間，h第84頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三對于同步生長型，其產(chǎn)酶速率與生長直接相關，其非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率β=0，產(chǎn)酶動力學方程為：生產(chǎn)上可通過獲得高的比生長速率來提高產(chǎn)物合成速度。第85頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三中期合成期的酶，其合成模式是一種特殊的生長偶聯(lián)型，當培養(yǎng)液中有阻遏物存在時，生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)α=0，即無酶產(chǎn)生，在細胞生長，阻遏物被細胞利用完后阻遏作用解除，酶才開始合成，此階段，產(chǎn)酶動力學方程與同步合成型相同。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml第86頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三滯后合成型為非生長偶聯(lián)型，生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)α=0，產(chǎn)酶動力學方程為：對于這類非生長偶聯(lián)型產(chǎn)酶來說，應當充分注意菌體在生長期和產(chǎn)酶期的營養(yǎng)要求的差別，可適當配用快速利用和緩慢利用的營養(yǎng)物的比例，分別滿足不同時期菌體細胞的需要。第87頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三延續(xù)合成型酶，在生長期和平衡期都可以產(chǎn)酶，其產(chǎn)酶動力學方程為：第88頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三四、固定化細胞生長和產(chǎn)酶動力學1、固定化細胞生長動力學

在適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，固定在載體上的細胞能以一定的速度生長。隨著細胞的生長和繁殖，有一些細胞脫落到培養(yǎng)液中，而成為游離細胞，它們也在培養(yǎng)液中生長。固定化細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中，包括兩部分細胞：固定在載體上的細胞、游離細胞。第89頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第90頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三細胞生長速率與細胞濃度（X）和比生長速率（μ）成正比，即：根據(jù)莫諾德方程，，固定化細胞生長動力學方程可以表示為：μmg、μmf分別代表固定在載體上的細胞和游離細胞的最大生長速率Kmg、Kmf分別代表固定在載體上的細胞和游離細胞的莫諾德常數(shù)。第91頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、固定化細胞產(chǎn)酶動力學固定化細胞產(chǎn)酶速率由固定化細胞產(chǎn)酶速率和游離細胞產(chǎn)酶速率組成，即：延續(xù)合成型固定化細胞產(chǎn)酶動力學方程：

αμ+β為游離細胞比產(chǎn)酶速率；γ為固定在載體上細胞的產(chǎn)酶速率第92頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三同步合成型固定化細胞產(chǎn)酶動力學方程為：中期合成型固定化細胞產(chǎn)酶動力學方程為：當有阻遏物時，dE/dt=0當培養(yǎng)基中阻遏物被消耗完后，第93頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三滯后合成型固定化細胞產(chǎn)酶動力學方程：第94頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3、固定化細胞連續(xù)產(chǎn)酶動力學第95頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第五節(jié)動植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

細胞種類植物細胞微生物細胞動物細胞細胞大小/um20-3001-1010-100倍增時間/h>120.3-6>15營養(yǎng)要求復雜簡單復雜光照要求大多數(shù)要光照不要求不要求對剪切力敏感大多數(shù)不敏感敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗體、酶第96頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三從表中可見其差異，主要有幾點：動植物細胞比微生物細胞大得多。動植物細胞對剪切力敏感，其中動物細胞沒有細胞壁，更為敏感。動植物細胞生長速率與代謝速率低、生長倍增時間和發(fā)酵周期均長。動物細胞營養(yǎng)要求比微生物細胞和植物細胞復雜，往往要求有血清或其他代用品。生產(chǎn)的主要產(chǎn)物各不相同。第97頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三動植物細胞培養(yǎng)有其缺點：動植物細對剪切力敏感，要求特殊生物反應器和培養(yǎng)方法。動植物細胞對防止雜菌污染的技術要求高；動物細胞營養(yǎng)要求苛刻。第98頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三二、動物細胞的培養(yǎng)產(chǎn)酶1、植物細胞培養(yǎng)的特點從天然植物中提取的方式的缺點：天然植物的產(chǎn)量低許多野生植物趨于瀕?；驕缃^引種馴化困難受自然環(huán)境和耕地的影響，栽培中產(chǎn)量和質(zhì)量難以控制第99頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三植物細胞培養(yǎng)的優(yōu)點：產(chǎn)率高產(chǎn)品質(zhì)量高生產(chǎn)周期短可實現(xiàn)自動化可以進行特定的生物轉(zhuǎn)化反應和探索新的合成路徑，以獲得新的有用物質(zhì)第100頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三植物細胞培養(yǎng)的特性：細胞個大，抗剪切力低生長速度慢，為防止培養(yǎng)過程中染菌，需加抗生素細胞易聚集成團產(chǎn)物在細胞內(nèi)且產(chǎn)量低細胞培養(yǎng)需氧，而培養(yǎng)液黏度大，且不能強力通風攪拌第101頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三產(chǎn)酶植物細胞酶種類胡蘿卜細胞糖苷酶紫苜蓿細胞β-半乳糖苷酶假挪威槭細胞漆酶甜菜細胞、大豆細胞過氧化物酶利馬豆細胞β-葡萄糖苷酶甜菜細胞酸性轉(zhuǎn)化酶甜菜細胞堿性轉(zhuǎn)化酶甜菜細胞糖化酶花生細胞、大豆細胞苯丙氨酸裂合酶番木瓜細胞木瓜蛋白酶大蒜細胞超氧化物歧化酶菠蘿細胞菠蘿蛋白酶劍麻細胞劍麻蛋白酶番木瓜細胞木瓜凝乳蛋白酶第102頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第103頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第104頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第105頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、植物細胞培養(yǎng)的工藝過程細胞培養(yǎng)的一般工藝：材料的選擇和消毒細胞的獲得細胞培養(yǎng)產(chǎn)物分離純化產(chǎn)品第106頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（1）材料的選擇與消毒無病蟲害，生長力旺盛，生長有規(guī)則的植株，從產(chǎn)生次級代謝物的組織部位中切取部分組織。取0.5-1cm的片段或小塊消毒、漂洗。消毒劑：70-75%酒精、5%次氯酸鈉、10%的漂白粉、0.1%升汞等。第107頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（2）植物細胞的獲取

①直接分離法：機械法：將外植體材料輕輕搗碎或用勻漿器破碎，然后用紗布或金屬濾網(wǎng)過濾，并離心分離細胞。酶解法：用果膠酶、纖維素酶等處理外殖體后分離有代謝活性的細胞。（須用甘露醇等進行滲透壓保護）第108頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三②愈傷組織誘導法愈傷組織能迅速增殖的無特定結構和功能的簿壁細胞團?？捎赏庵丑w培養(yǎng)1-3周而形成。過程：含一定量的生長素和分裂素的液體培養(yǎng)基中加入0.7—0.8的瓊脂，制成半固體誘導培養(yǎng)基、滅菌、外植體植入、25C培養(yǎng)、長出愈傷組織后分散繼代培養(yǎng)。分散細胞可用小細胞團移入液體培養(yǎng)液中，加玻璃珠，振蕩培養(yǎng)，然后用適當孔徑的不誘鋼篩網(wǎng)過濾。第109頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三③原生質(zhì)體再生法：原生質(zhì)體可用植物單細胞、愈傷組織和植物的組織器官制備。常用的有纖維素酶和果膠酶的混合物。滲透壓穩(wěn)定劑：甘露醇、蔗糖、葡萄糖、鹽類、山梨醇原生質(zhì)體分離后，在一定條件下培養(yǎng)，再生細胞壁成單細胞懸浮液。單細胞培養(yǎng)細胞團細胞系第110頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第111頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第112頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（3）植物細胞懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點：能提供大量均勻的細胞團細胞增殖的速度比愈傷組織快，適合大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)方式：分批培養(yǎng)法半連續(xù)培養(yǎng)