基因工程第七章DNA定點誘變

基因工程第七章DNA定點誘變第一頁，共57頁。定點誘變隨機誘變(molecularevolution)

易錯PCR(erro-pronePCR)DNA重排(DNAshuffing)體外隨機引發(fā)重組(random-priminginvitrorecombination)交錯延伸(staggerextensionprocess，StEP)突變方式第二頁，共57頁。突變類型單個堿基的置換(basesubstitution)簡單的插入或缺失(insertionordeletion)系統(tǒng)的缺失、插入或成串堿基的置換第三頁，共57頁。第一節(jié)寡核苷酸介導(dǎo)的誘變oligonucleotide-mediatedmutagenesis70年代初×174DNA(ssDNA5386bp),當用帶琥珀突變的ssDNA與變性的野生型DNA片段一起轉(zhuǎn)染細菌時,觀察到“標記獲救”現(xiàn)象,即產(chǎn)生帶野生型基因組的噬菌體第四頁，共57頁。野生型DNA片段突變體×174DNA+退火異源雙鏈體宿主編碼的錯配修復(fù)系統(tǒng)全長的野生型基因組可利用突變的DNA片段將突變引入到野生型DNA中第五頁，共57頁。M.Smith1993年諾貝爾化學獎加拿大生物化學家1932年出生于英國，畢業(yè)于英國曼徹斯特大學，1956年移居加拿大?，F(xiàn)任加拿大溫哥哥華大不列顛哥倫比亞大學生物技術(shù)實驗室主任。

1978年發(fā)明了寡聚核苷酸定點誘變技術(shù)。利用寡聚核苷酸定點誘變技術(shù)，可以人為地通過基因的改變來修飾、改造某一已知的蛋白質(zhì)，從而可以研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系、蛋白質(zhì)分子之間的相互作用。第六頁，共57頁。一、Kunkel法或稱“U”法第七頁，共57頁。

dut-

dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置一、Kunkel法或稱“U”法1．背景知識第八頁，共57頁。

dut-

dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置一、Kunkel法或稱“U”法ung-

UDG酶缺陷,UDG酶[尿嘧啶(uracil)-N-糖基化酶(glycosylase)]可除去摻入DNA中的尿嘧啶殘基1．背景知識第九頁，共57頁。E.coli(dut-/ung-)

合成的DNA含有尿嘧啶，M13噬菌體DNA中將含有20-30個尿嘧啶堿基E.coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)pCJ105isaF’plasmid第十頁，共57頁。ssDNA制備載體第十一頁，共57頁。ssDNA制備載體單鏈噬菌體載體phagemid載體第十二頁，共57頁。UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火T4DNApolymeraseDNAligase轉(zhuǎn)化MV1190(dut+/ung+)2．原理只有突變鏈能復(fù)制第十三頁，共57頁。2．原理第十四頁，共57頁。2．原理第十五頁，共57頁。InserttargetDNA2．原理第十六頁，共57頁。UUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ2362．原理第十七頁，共57頁。UUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染2．原理第十八頁，共57頁。UUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火2．原理第十九頁，共57頁。UUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火2．原理第二十頁，共57頁。UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火T4DNApolymeraseDNAligase2．原理第二十一頁，共57頁。UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火T4DNApolymeraseDNAligase轉(zhuǎn)化E.coliMV1190(dut+/ung+)2．原理第二十二頁，共57頁。UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火T4DNApolymeraseDNAligase2．原理只有突變鏈能復(fù)制轉(zhuǎn)化E.coliMV1190(dut+/ung+)第二十三頁，共57頁。UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火T4DNApolymeraseDNAligase2．原理只有突變鏈能復(fù)制轉(zhuǎn)化E.coliMV1190(dut+/ung+)第二十四頁，共57頁。(1)DNApolymerase

T4T7Klenow65%11/1336%突變率

(84.6%)3.酶第二十五頁，共57頁。(1)DNApolymerase

T4T7Klenow(可能會替換引物)65%11/1336%突變率

(84.6%)3.酶第二十六頁，共57頁。(1)DNApolymerase

T4T7Klenow(可能會替換引物)65%11/1336%突變率

(84.6%)(2)ligase3U/13l可有可無，有則效率高

3.酶第二十七頁，共57頁。(1)DNApolymerase

T4T7Klenow(可能會替換引物)65%11/1336%突變率

(84.6%)(2)ligase3U/13l可有可無，有則效率高

(3)T4gene32protein

提高含二級結(jié)構(gòu)的ssDNA的突變率3.酶第二十八頁，共57頁。4.primers要求5’端磷酸化

引物的終極條件：與靶DNA正確配對特異性地與靶DNA序列退火第二十九頁，共57頁。A.單核苷酸置換插入or缺失5’端完全配對，使得上游(引物)起始的DNA合成不容易將誘變寡核苷酸取代，約需8-10bp3’端所形成的雜交體足以引導(dǎo)DNA合成。如果錯配核苷酸太靠近3’端，3’端將不能形成穩(wěn)定的雜交體，易被外切活性降解。所以3’端需有7-9bp完全配對;第三十頁，共57頁。為便于篩選，應(yīng)選用可形成穩(wěn)定雜交體而長度最短的誘變寡核苷酸。一般17-19bp,錯配在中央，使得完全配對的雜交體與錯配雜交體之間的熱穩(wěn)定性差異足夠大。第三十一頁，共57頁。B.多處缺失或變換2個bp以上的oligo

兩側(cè)需12-15bp

側(cè)翼雙鏈區(qū)的Tm應(yīng)約為35-40℃Tm=4(G+C)+2(A+T)=36℃(3each)突變區(qū)域大,效率越低(兩側(cè)形成穩(wěn)定雜交體的能力是突變區(qū)長度的函數(shù)→越低）第三十二頁，共57頁。5.模板/結(jié)果靶DNA盡可能短，應(yīng)測序確定其突變

第三十三頁，共57頁。第三十四頁，共57頁。二、AlteredSites?IIinvitromutagenesissystem位點選擇定點誘變法

第三十五頁，共57頁。第三十六頁，共57頁。三、TransformerSite-Directedmutagenesis轉(zhuǎn)化子誘變法

第三十七頁，共57頁。SynthesizesecondstrandDigestDNA(primarydigestion)TransformE.coli

mutS

topropagateplasmidsIsolateanddigest(Seconddigestion)TransformE.coliIsolateDNA第三十八頁，共57頁。第三十九頁，共57頁。四、PCR定點誘變1．同源重組法第四十頁，共57頁。2．DpnI法第四十一頁，共57頁。第四十二頁，共57頁。3.重疊延伸Overlapextension對于兩個具有部分重疊序列的DNA片段，在經(jīng)過變性和復(fù)性后，兩個DNA片段之間通過同源序列形成部分雜合的雙鏈，在DNA聚合酶作用下，雜合雙鏈可互為引物和模板，引導(dǎo)DNA的合成，從而形成雜合DNA雙鏈第四十三頁，共57頁。五、SOE重疊延伸剪接術(shù)

Splicingbyoverlapextension可用于將兩個DNA片段在所期望的位點進行連接設(shè)計一個寡聚體引物，其序列包含兩個部分，“引發(fā)”和“重疊”部分，引發(fā)部分在3‘末端，起引物作用；重疊部分在5’末端，與待融合的DNA片段序列互補。設(shè)計另一個引物，該引物與上一個引物完全互補第四十四頁，共57頁。ATGATGATGATG第四十五頁，共57頁。ATGATGEcoRIBamHIBamHIATGEcoRIATGBamHIATGEcoRIPCRPCR重疊延伸PCR第四十六頁，共57頁。第四十七頁，共57頁。第二節(jié)嵌套缺失第四十八頁，共57頁。第二節(jié)嵌套缺失1.外切核酸酶III的消化ExonucleaseIII5‘3‘5‘3‘5‘3‘第四十九頁，共57頁。第五十頁，共57頁。2.BAL31的消化主要活性為3’外切核酸酶活性，可從線性DNA兩條鏈的3’端去掉除單核苷酸，還是一個內(nèi)切核酸(單鏈，nick,gap)

依賴Ca++EGTA可抑制活性第五十一頁，共57頁。AABAdigestionvectorinsertBAL31BdigestionDeletedinsertsclonedtoplasmidvector第五十二頁，共57頁。3.DNaseI的消化內(nèi)切酶，可優(yōu)先嘧啶核苷酸水解dsorssDNAMg2+:獨立作用于每條DNA鏈，位點隨機Mn2+:大致在同一位置切割dsDNA

產(chǎn)生平端或1-2個核苷酸突出第五十三頁，共57頁。cccDNADNaseI,Mn++(lowconcentration)AdigestionKlenowre-ligation第五十四頁，共57頁。EcoRIHindIIIStyIStyIScaIClaIHindIIISalIFspIClaIFspIKpnIEcoRI1660950185021002260270034003430380060006600