固定化酶和固定化細(xì)胞

第四章固定化酶和固定化細(xì)胞（2學(xué)時(shí)）主要內(nèi)容：1固定化酶的定義與優(yōu)點(diǎn)2酶固定化技術(shù)發(fā)展史3固定化酶的制備方法4固定化酶的特性

5固定化活細(xì)胞6酶催化反應(yīng)器及其類(lèi)型1醫(yī)學(xué)ppt游離酶的使用蒸汽→酶解罐簡(jiǎn)易圖加熱滅酶酶無(wú)法回收穩(wěn)定性差2醫(yī)學(xué)ppt1固定化酶的定義與優(yōu)點(diǎn)所謂固定化酶(immobilizedenzyme)，是指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶。3醫(yī)學(xué)ppt固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：（1）同一批固定化酶能在工藝流程中重復(fù)多次地使用；（2）固定化后，和反應(yīng)物分開(kāi)，有利于控制生產(chǎn)過(guò)程，同時(shí)也省去了熱處理使酶失活的步驟；（3）穩(wěn)定性顯著提高；（4）可長(zhǎng)期使用，并可預(yù)測(cè)衰變的速度；（5）提供了研究酶動(dòng)力學(xué)的良好模型。4醫(yī)學(xué)ppt2酶固定化技術(shù)發(fā)展史

起始研究1916年系統(tǒng)研究1950年-工業(yè)化應(yīng)用1969年-1916年，Nelson和Griffin將蔗糖酶吸附在骨炭粉上，吸附以后酶不溶于水且具有和液體酶同樣的活性，實(shí)現(xiàn)了酶的固定化，可惜長(zhǎng)期未得到重視。1953年Grubhofer和Schleith將聚氨基苯乙烯樹(shù)脂重氮化，然后將淀粉酶等與這種載體結(jié)合，制成了固定化酶。60年代后期，酶固定化技術(shù)迅速發(fā)展，出現(xiàn)了很多新的酶固定化方法。1969年，千畑一郎等將固定化氨基?；笐?yīng)用于DL-氨基酸的光學(xué)拆分上，來(lái)生產(chǎn)L-氨基酸，開(kāi)創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的先例。1973年，將固定化微生物細(xì)胞首次應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。5醫(yī)學(xué)ppt目前，固定化技術(shù)已經(jīng)取得了許多重要成果，充分發(fā)揮了固定化酶和固定化細(xì)胞在改革工藝和降低成本方面的巨大潛力。但從目前的發(fā)展?fàn)顩r來(lái)看，盡管酶種類(lèi)繁多，但已經(jīng)固定化的酶卻相對(duì)有限，采用固定化酶技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)的企業(yè)尚屬少數(shù)，真正在工業(yè)上使用的固定化酶還僅限于葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶和青霉素?；傅葹閿?shù)不多的十幾個(gè)酶種，故仍需大力研究開(kāi)發(fā)使更多的固定化酶和細(xì)胞能適用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。應(yīng)用現(xiàn)狀：6醫(yī)學(xué)ppt3固定化酶的制備方法酶的固定化方法主要可分為四類(lèi)：吸附法、包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法和交聯(lián)法。對(duì)于特定的目標(biāo)酶，要根據(jù)酶自身的性質(zhì)、應(yīng)用目的、應(yīng)用環(huán)境來(lái)選擇固定化載體和方法。7醫(yī)學(xué)ppt在具體選擇時(shí)，一般應(yīng)遵循以下6個(gè)原則。

（1）酶與載體的結(jié)合部位不應(yīng)當(dāng)是酶的活性部位，固定化時(shí)應(yīng)采取盡可能溫和的條件。（2）酶與載體必須有一定的結(jié)合程度，利于反復(fù)使用。（3）用于固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度，不易破壞或受損。（4）固定化應(yīng)盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高催化效率和產(chǎn)物的量。（5）所選載體應(yīng)不和底物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。（6）固定化酶的成本適中，以利于工業(yè)使用。8醫(yī)學(xué)ppt3.1吸附法吸附法是通過(guò)載體表面和酶分子表面間的次級(jí)鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，是固定化中最簡(jiǎn)單的方法。酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法。9醫(yī)學(xué)ppt物理吸附法是通過(guò)物理方法將酶直接吸附在水不溶性載體表面上而使酶固定化的方法。是制備固定化酶最早采用的方法。常用的載體：纖維素、膠原、淀粉及面筋、活性炭、氧化鋁、皂土、多孔玻璃、硅膠、二氧化鈦、羥基磷灰石等。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、價(jià)廉、條件溫和，載體可反復(fù)使用，酶與載體結(jié)合后，活性部位及空間構(gòu)象變化不大，固定化酶活力較高。缺點(diǎn)：酶和載體結(jié)合不牢固，在使用過(guò)程中容易脫落，常與交聯(lián)法結(jié)合使用。（1）物理吸附法10醫(yī)學(xué)ppt離子吸附法(ionadsorption)是將酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體以靜電作用力相結(jié)合的固定化方法，即通過(guò)離子鍵使酶與載體相結(jié)合的固定化方法。DEAE-纖維素吸附的α-淀粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶。具有操作簡(jiǎn)便、條件溫和、酶活力不易喪失等優(yōu)點(diǎn)。此外，吸附過(guò)程同時(shí)可以純化酶。（2）離子吸附法11醫(yī)學(xué)ppt3.2包埋法包埋法是將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。12醫(yī)學(xué)ppt（1）凝膠包埋法凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯(lián)樹(shù)脂等合成凝膠或樹(shù)脂。1-2%海藻酸鈉+酶液EEEE5%CaCl2溶液13醫(yī)學(xué)ppt（2）微膠囊包埋法微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物制成的半透膜微膠囊內(nèi)的方法。它使酶存在于類(lèi)似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外的環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。常用于制造微膠囊的材料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。適合于小分子為底物和產(chǎn)物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、過(guò)氧化氫酶等。14醫(yī)學(xué)ppt3.3共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法(covalentbinding）是將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法。酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團(tuán)有以下幾種：（1）酶蛋白N末端的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天門(mén)冬氨酸殘基的β-羧基以及谷氨酸殘基的γ-羧基。（3）半胱氨酸殘基的巰基。（4）絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基。（5）組氨酸殘基的咪唑基。（6）色氨酸殘基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)。15醫(yī)學(xué)ppt其中最普遍的共價(jià)鍵結(jié)合基團(tuán)是氨基、羧基以及苯環(huán)。常用來(lái)和酶共價(jià)偶聯(lián)的載體的功能基團(tuán)有芳香氨基、羥基、羧基和羧甲基等。這種方法是固定化酶研究中最活躍的一大類(lèi)方法，但必須注意，參加共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)是酶催化活性非必需基團(tuán)，如若共價(jià)結(jié)合包括了酶活性中心有關(guān)的基團(tuán)，會(huì)導(dǎo)致酶的活力損失。16醫(yī)學(xué)ppt用共價(jià)鍵結(jié)合法制備的固定化酶，酶和載體之間都是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)以共價(jià)鍵偶聯(lián)。由于共價(jià)鍵的鍵能高，酶和載體之間的結(jié)合相當(dāng)牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會(huì)使酶分子從載體上脫落下來(lái)，具有酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。但是采用該方法時(shí)，載體活化的難度較大，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件較劇烈，制備過(guò)程中酶直接參與化學(xué)反應(yīng)，易引起酶蛋白空間構(gòu)象變化，酶活回收率一般為30%左右，甚至酶的底物的專一性等性質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化，往往需要嚴(yán)格控制操作條件才能獲得活力較高的固定化酶。17醫(yī)學(xué)ppt3.4交聯(lián)法交聯(lián)法（cross-linking）是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。由于酶蛋白的功能團(tuán)，如氨基、酚基、巰基等參與反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，使酶明顯失活。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、雙偶氮聯(lián)苯和N,N′-乙烯雙順丁烯二酰亞胺等，其中使用最廣泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生Schiff反應(yīng)，形成薛夫堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶。18醫(yī)學(xué)ppt以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)（見(jiàn)表4-1）。往往一種酶可以用不同方法固定化，但沒(méi)有一種固定化方法可以普遍地適用于每一種酶。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，常將兩種或數(shù)種固定化方法并用，以取長(zhǎng)補(bǔ)短。19醫(yī)學(xué)ppt4固定化酶的特性20醫(yī)學(xué)ppt4.1固定化酶的形狀固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。其中顆粒占絕大多數(shù)，它和線條主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反應(yīng)器中進(jìn)行批式攪拌反應(yīng)；薄膜主要用于酶電極，應(yīng)用于分析化學(xué)；酶管機(jī)械強(qiáng)度較大，亦宜用于工業(yè)生產(chǎn)。21醫(yī)學(xué)ppt4.2酶活力固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是：①酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相結(jié)合；②當(dāng)酶與載體結(jié)合時(shí)，它的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化；③酶與底物間的相互作用受到空間位阻的影響。也有在個(gè)別情況下，酶經(jīng)固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游離酶活力高。22醫(yī)學(xué)ppt4.3固定化酶的穩(wěn)定性

1）操作穩(wěn)定性一般情況下，半衰期在一個(gè)月以上，即有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。3）熱穩(wěn)定性大多數(shù)酶在固定化后，熱穩(wěn)定性提高，但有些酶采用吸附法固定化時(shí)會(huì)降低。2）貯藏穩(wěn)定性可延長(zhǎng)酶的貯藏有效期。如果貯藏條件比較好，亦可較長(zhǎng)時(shí)間保持活力。4）對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性由于酶固定化后受到空間位阻的影響，蛋白酶不能有效接觸，因此抵抗力提高。5）酸堿穩(wěn)定性多數(shù)固定化酶的酸堿穩(wěn)定性提高。極少數(shù)酶固定化后由于酶活性構(gòu)象的敏感區(qū)受到牽連導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。23醫(yī)學(xué)ppt4.4固定化酶的反應(yīng)特性固定化酶的反應(yīng)特性，例如，底物特異性、酶反應(yīng)的最適pH、酶反應(yīng)的最適溫度、動(dòng)力學(xué)常數(shù)、最大反應(yīng)速度等均與游離酶有所不同。24醫(yī)學(xué)ppt（1）底物特異性固定化酶的底物特異性與底物分子量的大小有一定關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)酶的底物為小分子化合物時(shí)，固定化酶的底物特異性大多數(shù)情況下不發(fā)生變化。而當(dāng)酶的底物為大分子化合物時(shí)，如蛋白酶、α-淀粉酶、磷酸二酯酶等，一般隨著底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。這是由于載體引起的空間位阻作用，使大分子底物難以與酶分子接近而無(wú)法進(jìn)行催化反應(yīng)，酶的催化活力難以發(fā)揮出來(lái)，催化活性大大下降。例如，糖化酶用CMC疊氮衍生物固定化時(shí)，對(duì)分子量8000的直鏈淀粉的活性為游離酶的77％，而對(duì)分子量為50萬(wàn)的直鏈淀粉的活性只有15%～17％。25醫(yī)學(xué)ppt（2）反應(yīng)的最適pH酶被固定后，其最適pH和pH曲線常會(huì)發(fā)生偏移。一般來(lái)說(shuō)，產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的最適pH與游離酶相比升高；產(chǎn)物為堿性時(shí)，固定化酶的最適pH與游離酶相比降低。26醫(yī)學(xué)ppt（3）反應(yīng)的最適溫度

固定化酶的最適反應(yīng)溫度多數(shù)較游離酶高。如色氨酸酶經(jīng)共價(jià)結(jié)合后最適溫度比固定前提高5～15℃，但也有不變甚至降低的。固定化酶的作用最適溫度會(huì)受固定化方法以及固定化載體的影響。27醫(yī)學(xué)ppt（4）米氏常數(shù)酶經(jīng)固定化后，酶蛋白分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化以及載體電荷的影響可導(dǎo)致底物和酶的親合力的變化。使用載體結(jié)合法制成的固定化酶Km有時(shí)變動(dòng)的原因，主要是由于載體與底物間的靜電相互作用的緣故。28醫(yī)學(xué)ppt（5）最大反應(yīng)速度固定化酶的最大反應(yīng)速度與游離酶大多數(shù)是相同的。有些酶的最大反應(yīng)速度會(huì)因固定化方法的不同而有所差異。29醫(yī)學(xué)ppt5固定化活細(xì)胞20世紀(jì)70年代，在固定化酶的基礎(chǔ)上科學(xué)家們研制成固定化細(xì)胞（ImmobilizedCell），并且用于生產(chǎn)。直接固定那些含有所需胞內(nèi)酶的細(xì)胞，并且利用這樣的細(xì)胞來(lái)催化化學(xué)反應(yīng)。70年代末，法國(guó)研究成功固定化細(xì)胞生產(chǎn)啤酒，80年代初我國(guó)居乃琥等用固定化細(xì)胞批量生產(chǎn)啤酒和酒精取得重要研究成果。固定化細(xì)胞按其生理狀態(tài)又可分為固定化死細(xì)胞和活細(xì)胞兩大類(lèi)。30醫(yī)學(xué)ppt固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)：固定化活細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)①必須保持菌體的完整，防止菌體的自溶，否則影響產(chǎn)物的純度；②必須抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)目的酶的分解；③胞內(nèi)多酶的存在，會(huì)形成副產(chǎn)物；④載體、細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會(huì)造成底物滲透與擴(kuò)散的障礙等。①無(wú)需進(jìn)行酶的分離和純化，減少酶活損失，降低成本；②可進(jìn)行多酶反應(yīng)，且不需添加輔助因子；③活細(xì)胞保持了酶的原始狀態(tài)，穩(wěn)定性更高，對(duì)污染的抵抗力更強(qiáng)；④細(xì)胞生長(zhǎng)停滯時(shí)間短，細(xì)胞多，反應(yīng)快等等。物理吸附法包埋法31醫(yī)學(xué)ppt

6酶催化反應(yīng)器及其類(lèi)型以酶為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需要的設(shè)備稱之為酶催化反應(yīng)器，簡(jiǎn)稱酶反應(yīng)器。32醫(yī)學(xué)ppt6.1酶反應(yīng)器的類(lèi)型酶反應(yīng)器有兩種類(lèi)型：一類(lèi)是直接用游離酶進(jìn)行反應(yīng)，即均相酶反應(yīng)器；另一類(lèi)是應(yīng)用固定化酶進(jìn)行的非均相酶反應(yīng)器。均相酶反應(yīng)能在批量式攪拌桶反應(yīng)器或超濾膜反應(yīng)器中進(jìn)行，而非均相酶反應(yīng)則可在多種反應(yīng)器中進(jìn)行，適用于連續(xù)催化反應(yīng)，包括：連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器、填充床反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、連續(xù)攪拌桶-超濾和循環(huán)式反應(yīng)器等。33醫(yī)學(xué)ppt

6.2反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

34醫(yī)學(xué)ppt這類(lèi)反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，造價(jià)較低，傳質(zhì)阻力很小，反應(yīng)能迅速達(dá)到穩(wěn)態(tài)，主要應(yīng)用在飲料等食品工業(yè)中。其缺點(diǎn)是操作麻煩，在反復(fù)回收過(guò)程中固定化酶容易損失，所以工業(yè)規(guī)模的固定化酶很少采用。但是，常用于游離酶。圖4-2批量式攪拌桶反應(yīng)器6.2.1批量式攪拌桶反應(yīng)器35醫(yī)學(xué)ppt這種反應(yīng)器在運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中，底物以恒定的流速流入反應(yīng)器，與此同時(shí)，反應(yīng)液則以同樣的流速流出反應(yīng)器。反應(yīng)桶內(nèi)裝有攪拌器，使反應(yīng)組分與固定化酶顆?；旌暇?，出口處有過(guò)濾膜，可使不斷補(bǔ)充新鮮底物與反應(yīng)液流量維持動(dòng)態(tài)平衡，如圖4-3。

6.2.2連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器圖4-3連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器36醫(yī)學(xué)ppt6.2.3填充床反應(yīng)器圖4-4填充床反應(yīng)器PBR具有高效率、易操作、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。它適用于各種形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液，以及有產(chǎn)物抑制的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。其缺點(diǎn)是傳質(zhì)系數(shù)和傳熱系數(shù)相對(duì)較低。當(dāng)?shù)孜锶芤汉腆w顆?；蝠ざ群艽髸r(shí)，不宜采用目前工業(yè)生產(chǎn)及研究中應(yīng)用最為普遍的反應(yīng)器。37醫(yī)學(xué)ppt6.2.4

流化床反應(yīng)器圖4-5流化床反應(yīng)器主要被用來(lái)處理一些粘度高的液體和顆粒細(xì)小的底物，如用于水解牛乳中的蛋白質(zhì)。同時(shí)，亦可用于需要供氣體或排放氣體的酶反應(yīng)（即固、液、氣三相反應(yīng)）。但因FBR混合均勻，故不適用于有產(chǎn)物抑制的酶反應(yīng)。38醫(yī)學(xué)ppt6.2.5連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器(CSTR／UF)圖4-6連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器適用于顆粒較細(xì)的固定化酶、游離酶和細(xì)胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。如：纖維素的連續(xù)糖化、α-淀粉酶水解淀粉39醫(yī)學(xué)ppt6.2.6

循環(huán)反應(yīng)器（RecycleReactor，RCR）外循環(huán)反應(yīng)器內(nèi)循環(huán)反應(yīng)器循環(huán)操作仍能為底物與酶提供足夠的接觸機(jī)會(huì)，以達(dá)到所需的轉(zhuǎn)化率。這種反應(yīng)器可用于難溶或者不溶性底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。40醫(yī)學(xué)ppt

6.3膜式反應(yīng)器膜式反應(yīng)器是20世紀(jì)70年代以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型反應(yīng)器，它是利用膜的分離功能，同時(shí)完成反應(yīng)和分離過(guò)程的一種反應(yīng)器。6.3.1膜式反應(yīng)器的類(lèi)型：根據(jù)酶的存在狀態(tài)、相數(shù)、膜組件型式、膜材料類(lèi)型、耦合方式、傳質(zhì)推動(dòng)力等的不同，酶膜反應(yīng)器有不同的分類(lèi)方式。根據(jù)膜組件的型式不同，可把酶膜反應(yīng)器分為板框式、螺旋卷式、管式和中空纖維式酶膜反應(yīng)器。以下以螺旋卷膜式反應(yīng)器和中空纖維膜式反應(yīng)器為例來(lái)說(shuō)明。41醫(yī)學(xué)ppt（1）螺旋卷膜式反應(yīng)器此反應(yīng)器的螺旋結(jié)構(gòu)是將含酶的膜片與支持材料交替地纏繞在中心棒上。所用的膜片一般是膠原蛋白；而支持材料則是一種稱為凡克塞的惰性聚合網(wǎng)狀物。把上述螺旋元件裝進(jìn)圓筒，筒兩端加蓋板，并安裝進(jìn)出口管，這樣，就制成了螺旋卷膜式反應(yīng)器。螺旋模型可將流體流動(dòng)的單元分隔成許多獨(dú)立空間，改善接觸效果，消除短路；另外，網(wǎng)狀支持材料可以提高每一流動(dòng)間隔的混合效果，加快物質(zhì)傳遞。42醫(yī)學(xué)ppt（2）中空纖維膜式反應(yīng)器外層：中空纖維膜水和小分子產(chǎn)物多孔海綿狀的支持層（固定酶）半透性膜大分子底物用這種固定化酶填充的反應(yīng)器可以提供較大的催化表面，缺點(diǎn)：中空纖維的制造極為困難，難以保證纖維束內(nèi)流體流動(dòng)的均勻性，以及存在較大的物質(zhì)傳遞阻力等。43醫(yī)學(xué)ppt6.3.2

膜式反應(yīng)器的特點(diǎn)（1）膜的選擇透過(guò)性使某些組分