SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE及western課件

實(shí)驗(yàn)八SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理2.掌握垂直板電泳的操作方法

3.熟悉蛋白印跡技術(shù)原理和方法二.實(shí)驗(yàn)原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳:是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉）1967年，Shapiro等人首先發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺凝膠中主要取決于三種因素：蛋白大小，形狀和電荷)系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量大?。慨?dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15,000－200,000之間時(shí)，樣品的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。符合如下方程式：LgMW=－bmR+K其中，MW為蛋白質(zhì)的分子量，mR為相對(duì)遷移率，b為斜率，K為截距。當(dāng)條件一定時(shí)，b與K均為常數(shù)因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較，就可以得出未知蛋白的分子量SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素/PVDF膜上，然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量實(shí)驗(yàn)操作大致流程圖SDS電泳轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜）封閉一抗洗滌酶標(biāo)二抗反應(yīng)洗滌顯色或化學(xué)發(fā)光顯影分離膠(10%10ml)濃縮膠(5%10ml)ddH2O4.05ml6.8ml30%Acr3.3ml1.7mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl2.5ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl1.25ml10%SDS100μl100μl10%Ap50μl100μlTEMED10μl10μl

配膠3.按比例配好分離膠,用移液管快速加入（或直接用小燒杯倒入）,大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水（或異丙醇除泡）,靜置至膠凝

*凝膠配制過程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無法注膠。注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡*水封的目的：保持分離膠上沿平直，排氣泡

*膠凝好的標(biāo)志：膠與水層之間形成清晰的界面

4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入梳子,靜置到膠凝

*梳子需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平5.拔出樣梳后,拆掉密封條，在內(nèi)槽中加入緩沖液*用吸瓶將加樣孔內(nèi)和玻璃板下面放密封條位置的氣泡全部排出8.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進(jìn)行電泳，開始電流恒定在10mA（120V），當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA（180V），溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約數(shù)cm時(shí)，停止電泳

9.凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入考馬斯亮藍(lán)染色染色液，染色1小時(shí)左右

10.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰

*剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無損,染色要充分11.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析按下式計(jì)算相對(duì)遷移率：

每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性五.分析計(jì)算=

蛋白樣品距加樣端遷移距離cm溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離cm

相對(duì)遷移率注意的問題蛋白質(zhì)電泳常用的SDS：?jiǎn)我粊喕M成的蛋白質(zhì)非變性PAGE：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)

聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套濃縮膠的作用濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選Tris/HCL緩沖液，電級(jí)液選Tris/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動(dòng)，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層常見問題及解決辦法1.紋理和拖尾現(xiàn)象：由于樣品溶解不好引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素2.蛋白帶過寬，與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多，可以減少上樣量3.電泳時(shí)間比正常要長(zhǎng)?？赡苡捎谀z緩沖系統(tǒng)和電級(jí)緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯(cuò)誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高4.指示劑成微笑符號(hào)（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形），說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率所致5.指示劑成微笑符號(hào)（指示劑前沿呈現(xiàn)向下的曲線形），由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片得凝膠聚和不完全6.凝膠時(shí)間不對(duì)。通常膠在30min-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時(shí)膠太硬易裂（7）10%過硫酸銨(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+溴酚藍(lán)（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。

（11）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R2500.125g，加上述固定液250ml，過濾后備用（12）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml（13）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml影響因素1.溶液中SDS單體的濃度，當(dāng)單體濃度大于1mmol/L時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4，如果單休濃度降到0.5mmol/L以下時(shí)，兩者的結(jié)合比僅為1:0.4這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為1:4或1:32.樣品緩沖液的離子強(qiáng)度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，通常是10～100mmol/L3.二硫鍵是否完全被還原麗春紅染色1.轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取下轉(zhuǎn)膜裝置，打開夾板，小心用鑷子取出尼龍膜，蛋白面朝上置于10ml1×的麗春紅染液中，搖床上染色10min左右2.蛋白面朝上，用去離子水洗3-4次，至紅色基本褪去后，拍照。3.再用去離子水洗膜至紅色完全褪去封閉取出兩塊膜，用濾紙將殘留液體吸凈后，將兩塊膜的蛋白面相對(duì)放入封閉液2.

RT，1-2hours或

4℃過夜一抗1把膜從冰箱中取出，RT，30min。注：封閉液可回收四個(gè)角蘸點(diǎn)水鋪好保鮮膜后，加1：100的一抗500ul（抗體稀釋液495ul+5ulmousep65抗體）于保鮮膜上蛋白面朝下，使尼龍膜和一抗充分接觸。注避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡，可用鑷子將膜的四角輕輕提起，排出氣泡蓋上玻璃平皿，RT下孵育2hoursTBST10min×2；TBS10min×1二抗1.同上鋪好保鮮膜，加1：1000的二抗1000ul（1ulmouse抗人IgG-HRP+999ul抗體稀釋液）2.同上蛋白面朝下放好尼龍膜，要避免產(chǎn)生氣泡3.

蓋上平皿，同上RT孵育2hours4.

TBST10min×2；TBS10min×1顯色1鋪好保鮮膜，分別滴加5滴發(fā)光試劑A和B，混合1min2

同上蛋白面朝下放好尼龍膜，要避免產(chǎn)生氣泡。反應(yīng)1min3

用鑷子夾起尼龍膜，用濾紙將多余的發(fā)光試劑吸盡，至沒有液體滴下為止4將尼龍膜蛋白面朝上置于另外兩塊鋪好的保鮮膜上。用濾紙將膜邊的殘余液體吸凈后，折回保鮮膜，將之放到壓膜用的夾板里轉(zhuǎn)膜戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因?yàn)槭稚系挠椭瑫?huì)阻斷轉(zhuǎn)移

濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致

以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜5min方向正確：凝膠在陰極，膜在陽(yáng)極排去濾紙、膠和膜間的氣泡電轉(zhuǎn)時(shí)間：200mA1-2h,轉(zhuǎn)移結(jié)束后，膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置（3）封閉5％脫脂奶粉或3％BSA（含0.1％Tween20TBS或PBS配制）時(shí)間：室溫3h或4oC過夜封閉液回收顯色辣根過氧化物酶：底物為DAB堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT

化學(xué)發(fā)光顯影最常用,辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同