生物蛋白質(zhì)修飾和表達(dá)

生物蛋白質(zhì)修飾和表達(dá)第1頁/共56頁蛋白質(zhì)的功能設(shè)計１．通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設(shè)計新的功能２．鍵合及催化的從頭設(shè)計３．在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點４．催化活性蛋白質(zhì)的設(shè)計５．膜蛋白及離子通道的設(shè)計６．新材料的設(shè)計第2頁/共56頁蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑蛋白質(zhì)修飾的分子生物學(xué)途徑第四章蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)第3頁/共56頁氨基的化學(xué)修飾三硝基苯磺酸與賴氨酸殘基反應(yīng)，在420nm和367nm能夠產(chǎn)生特定的光吸收。亞氨代乙?；簛啺贝阴；磻?yīng)可區(qū)分α-氨基和ε-氨基。完全亞氨代乙?；牡鞍踪|(zhì)仍保持在水溶液中的可溶性。α-異硫氰酸苯酯在嚴(yán)格控制的條件下可對α-氨基進(jìn)行相當(dāng)特異性的修飾，而不作用于ε-氨基。第4頁/共56頁羧基的化學(xué)修飾由于羧基在水溶液中的化學(xué)性知識的蛋白質(zhì)分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修飾方法很有限，產(chǎn)物一般是酯類或酰胺類。水溶性的碳化二亞胺類特定修飾羧基基團(tuán)，可在較溫和的條件進(jìn)行第5頁/共56頁氧化和還原反應(yīng)二硫鍵的還原：2-巰基乙醇、巰基乙酸和二硫蘇糖醇等。判斷蛋白質(zhì)分子中有無二硫鍵，是鏈內(nèi)二硫鍵還是鏈間二硫鍵的方法可用非還原/還原雙向SDS電泳技術(shù)。處理后的蛋白很容易自動氧化，重新形成二硫鍵，因而需要經(jīng)過羧甲基處理，防止重新形成二硫鍵。5，5’二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Ellman試劑），可與巰基反應(yīng)形成二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子上標(biāo)記1個2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同時釋放1個有很強(qiáng)顏色的TNB陰離子，可在412nm處通過光吸收的變化來監(jiān)測反應(yīng)的程度。Ellman是目前常用的定量測定蛋白質(zhì)分子巰基數(shù)目試劑，還被用于探測蛋白質(zhì)分子去折疊與再折疊時的構(gòu)象變化狀態(tài)及跟蹤構(gòu)象變化的過程。第6頁/共56頁化學(xué)修飾影響的條件1、溫和的反應(yīng)條件是防止蛋白質(zhì)分子變性的一個必要條件2、pH值得變化：決定了具有潛在反應(yīng)能力的基團(tuán)所處的可反應(yīng)和不可反應(yīng)的離子狀態(tài)。3、溫度：影響活性巰基的微環(huán)境4、有機(jī)溶劑：試劑需要有機(jī)溶劑來助溶，但有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)變性。第7頁/共56頁化學(xué)方法：

產(chǎn)生半合成的結(jié)構(gòu)，一個天然多肽與一個人造（或化學(xué)修飾）的多肽相締合非共價締合產(chǎn)生二硫鍵形成肽鍵產(chǎn)生非天然型的共價鍵第8頁/共56頁非共價締合在多肽鏈中如果出現(xiàn)一個切口，但多肽鏈并不因此分開，仍能保持其生物學(xué)活性。在變性系統(tǒng)中，破壞非共價鍵后，在非變性基質(zhì)中仍可形成原來的構(gòu)型，活力也隨之恢復(fù)。這一現(xiàn)象可用來產(chǎn)生半合成的類似物第9頁/共56頁產(chǎn)生二硫鍵二硫鍵被還原劑打開，多肽彼此分開

DTT、二硫蘇糖醇將這些片斷與適當(dāng)?shù)谋恍揎椀幕蚝铣傻牧硪浑南嗷旌?，通過重新形成二硫鍵而形成嵌合分子第10頁/共56頁形成肽鍵通過酶連接反應(yīng)形成肽鍵從豬胰島素生產(chǎn)人胰島素將B鏈丙氨酸殘基改為蘇氨酸殘基（胰蛋白酶）

通過酶法與活性酯偶聯(lián)羥基琥珀酰亞胺酯作為接頭分子第11頁/共56頁產(chǎn)生非天然型共價鍵利用雙功能試劑可以將不同的蛋白質(zhì)連在一起。常用的方法是將雙功能的接頭與兩個蛋白質(zhì)分子中的賴氨酸殘基側(cè)鏈相連接?？梢杂弥麈滊挎I產(chǎn)生尾-尾相連二聚體如：抗體制備具有不同功能的F（ab)2的類似物第12頁/共56頁蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)方法突變：寡核苷酸介導(dǎo)的定向突變、

PCR方法、盒式突變定向進(jìn)化：異錯PCR、基因家族改組技術(shù)表達(dá)體系原核表達(dá)：大腸桿菌真核表達(dá)：酵母、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞

二、蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第13頁/共56頁定位突變：在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定長度的核苷酸片斷優(yōu)點：突變率高、簡單易行、重復(fù)性好應(yīng)用：研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，讀基因調(diào)控機(jī)理、疾病的病因和機(jī)理方面研究應(yīng)用：寡核苷酸介導(dǎo)的定點突變、PCR方法介導(dǎo)的定點突變及盒式突變隨機(jī)突變優(yōu)點：在體外模擬自然進(jìn)化的過程常用手段：易錯PCR、基因家族改組技術(shù)（DNAfamilyshuffling)等

第14頁/共56頁寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變1、將待突變基因克隆到突變載體上2、制備含突變基因的單鏈模板;3、引物與模板退火，以5’端磷酸化的突變寡核苷酸引物,與待突變的核苷酸形成一小段堿基錯配的異源雙鏈的DNA,4、合成突變鏈:在DNA聚合酶的催化下,引物以單鏈DNA為模板合成全長的互補(bǔ)鏈,而后由連接酶封閉缺口,產(chǎn)生閉環(huán)的異源雙鏈的DNA分子;5、將異源雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,產(chǎn)生野生型、突變型的同源雙鏈DNA分子。可以用限制性酶切法、斑點雜交法和生物學(xué)方法對突變基因進(jìn)行篩選6、對突變基因序列進(jìn)行分析第15頁/共56頁寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變的改進(jìn)缺點：產(chǎn)生突變效率低，原因：大腸桿菌中存在甲基介導(dǎo)的堿基錯配修復(fù)系統(tǒng)改進(jìn)：KUNKEL用尿嘧啶取代DNA特點:1、采用甲基修復(fù)酶缺乏的菌株作為受菌體

2、采用改進(jìn)后的質(zhì)粒，省去制備單鏈模板的步驟

3、增加了多個抗生素篩選標(biāo)志和相對應(yīng)的多對敲除/修復(fù)引物，使質(zhì)粒進(jìn)行多次突變第16頁/共56頁UUUUUUUUUUUUUUUUUU3’5’P模板中尿嘧啶取代胸腺嘧啶尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷菌株ung-dUTP酶缺陷突變體dut-

轉(zhuǎn)染ung+模板鏈降解Kunkel方法寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變的改進(jìn)關(guān)鍵技術(shù)步驟：制備高質(zhì)量的含U的單鏈DNA模板宿主：E.coliCJ236品系第17頁/共56頁基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法多克隆位點TetrAmpsTetrAmps突變氨芐青霉素抗性的陽性克隆設(shè)計突變體引物氨芐青霉素抗性修復(fù)寡核苷酸第18頁/共56頁P(yáng)CR方法介導(dǎo)的定點突變通過改變引物中的某些堿基而改變基因序列，達(dá)到有目的改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系的目的取代突變、插入突變、缺失突變第19頁/共56頁5’3’5’3’5’3’5’3’第20頁/共56頁盒式突變盒式突變是利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片斷，取代野生型基因中的相應(yīng)序列，設(shè)計成粘性末端步驟：1、將克隆片斷用限制性內(nèi)切酶切割2、將合成的寡核苷酸片斷與酶切后的克隆片斷混合3、產(chǎn)生突變基因產(chǎn)物第21頁/共56頁限制性內(nèi)切酶目標(biāo)基因中要有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點：利用遺傳密碼簡并性確保盒式突變序列的正確插入方向第22頁/共56頁3種方法優(yōu)缺點比較1、寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變法

優(yōu)點：保真度比PCR突變法高，改進(jìn)后的突變成功率大大提高缺點：操作過程復(fù)雜、周期長，待突變位點會受到限制性酶切位點限制2、PCR方法優(yōu)點：操作簡單，突變成功功率達(dá)100%。缺點：后續(xù)工作復(fù)雜，要與載體相連；TaqDNA聚合酶保真性低，要分析學(xué)列3、盒式突變優(yōu)點：簡單、突變效率高缺點：合成多條引物的成本較高第23頁/共56頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化1993年，美國科學(xué)家ArnoldFh首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念易錯PCR技術(shù)為代表的無性進(jìn)化DNAshuffling為代表的有性進(jìn)化第24頁/共56頁定向進(jìn)化技術(shù)人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對基因進(jìn)行隨機(jī)突變，從一個或多個已經(jīng)存在的親本蛋白質(zhì)（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經(jīng)過基因的突變和重組，構(gòu)建一個人工突變酶庫，通過一定的篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化蛋白質(zhì)第25頁/共56頁定向進(jìn)化的原理第26頁/共56頁易錯PCR技術(shù)(error-pronePCR)DNA改組(DNAshuflling)：由美國Stemmer于1994年首次提出一項體外重組技術(shù)隨機(jī)引發(fā)重組(RPR)1998年,Arnold提出了一種有效的新方法交錯延伸技術(shù)(StEP)：由Zhao等提出,是一種簡化的DNAshuffling技術(shù)隨機(jī)突變的策略第27頁/共56頁易錯PCR（errorpronePCR）是指在擴(kuò)增目的基因的同時引入堿基錯配，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變連續(xù)易錯PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變易錯PCR第28頁/共56頁DNA改組和外顯子改組DNA改組(DNAshuffling)又稱有性PCR(sexualPCR)，原理如圖所示

外顯子改組(exonshuffling類似于DNA改組，與但與其不同，它是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動，而DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個基因片段上。第29頁/共56頁體外隨機(jī)引發(fā)重組

體外隨機(jī)引發(fā)重組(randompriminginvitrorecombination,RPR)以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點的短DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們互為引物進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度第30頁/共56頁交錯延伸

交錯延伸(staggerextensionprocess,StEP)在PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步,縮短其反應(yīng)時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過程反復(fù)進(jìn)行，直到產(chǎn)生完整的基因長度第31頁/共56頁定向進(jìn)化的篩選策略突變體分離瓊脂板涂布法在特殊條件下培養(yǎng)突變菌，通過宿主菌的生長情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因微孔板懸浮法在含生色底物平板上培養(yǎng)，挑取具有活性的克隆接種到96孔板上檢測吸光度。使用微流控芯片微球細(xì)胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合，將單個細(xì)胞附著在單個固體珠上，突變體進(jìn)行分離和篩選流式細(xì)胞計數(shù)法細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，排成單行，逐個通過流式細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行測定第32頁/共56頁通過酶促反應(yīng)的特征加入底物顯色熒光共振能量轉(zhuǎn)移同位素標(biāo)記底物通過檢測底物消耗或產(chǎn)物生成進(jìn)行終點檢測酶檢測信號探測分光光度計和熒光酶標(biāo)儀氣相色譜和高效液相色譜質(zhì)譜和核磁第33頁/共56頁定向進(jìn)化與自然進(jìn)化的異同點定向進(jìn)化的實質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。定向進(jìn)化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進(jìn)化，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展。兩者的不同：進(jìn)化動力不同：保守突變非保守取代；進(jìn)化方向不同：適應(yīng)突變的積累；進(jìn)化速度不同：非常漫長只需幾年、甚至幾天；

進(jìn)化目標(biāo)不同：適應(yīng)環(huán)境超越生物學(xué)意義的要求，探索所希望的蛋白質(zhì)在順序空間的可及性。第34頁/共56頁定向進(jìn)化技術(shù)Fig.1.Publicationrateofthe‘directedevolution’articlesinbiomedicalliteraturebetween1995and2004.TheanalysiswasachievedusingtheNationalInstitutesofHealthMEDLINEbibliographicdatabase.Thefigureshowsthetotalnumberofarticlespublishedeachyear,whichcontainthekeywords‘directedevolution’intheirtitles.第35頁/共56頁目標(biāo)酶所需功能方法結(jié)果實施菌種卡那霉素核苷基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性定位誘變+選擇在60-50℃酶半衰期增加200倍耐熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶作用于有機(jī)溶劑易錯PCR+選擇在60％二甲基亞砜主仆女冠活力增強(qiáng)170倍枯草桿菌β-內(nèi)酰胺酶作用于新底物DNA改組+選擇對cefotaxime的抗性增加32000倍大腸桿菌對硝基苯酯酶有機(jī)溶劑中的底物特異性和活性易錯PCR+重組活力增加60-150倍大腸桿菌胸苷激酶第五特異性基因理療交錯延伸+選擇活力增加43倍大腸桿菌β-半乳糖苷酶底物特異性DNA改組+選擇活力增加66倍底物特異性增加1000倍大腸桿菌砷酸脫毒途徑砷酸抗性DNA改組+選擇抗性增加12倍大腸桿菌定向進(jìn)化的應(yīng)用第36頁/共56頁第37頁/共56頁改進(jìn)的易錯PCR方法：MgCl2濃度增加到7mmol/L穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對；加入0.5mmol/LMnCl2降低聚合酶的特異性；dCTP和dTTP的濃度增加到1mmol/L促進(jìn)錯誤摻入；TaqDNA聚合酶量增加到5U以促進(jìn)延伸鏈在堿基錯配位置后得以繼續(xù)。第38頁/共56頁Figure1Theroutineofstaggerextensionprocess結(jié)果產(chǎn)生間隔含不同模板序列的新生DNA分子第39頁/共56頁Figure11Strategyoftheconstructionoftherecombinant

第40頁/共56頁Figure12Strategyofselectionoftherecombinantplasmid第41頁/共56頁基因融合避免外源蛋白的快速降解：小肽使表達(dá)產(chǎn)物快速、有效的回收和純化：分泌-親和融合、雙親和融合法、分泌-插入融合法定向分泌：信號肽體外切割：改變外源蛋白的溶解性，防止包涵體的形成：與硫氧化還原蛋白形成融合體研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能第42頁/共56頁融合基因的構(gòu)建的方法PCR方法蛋白質(zhì)內(nèi)含肽接到的蛋白質(zhì)分子的連接目標(biāo)蛋白或蛋白片段用pCYB作為表達(dá)載體進(jìn)行連接，產(chǎn)生目標(biāo)蛋白-蛋白內(nèi)含肽-甲殼素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。此蛋白與苯硫酚及合成肽一起融合，形成融合肽第43頁/共56頁載體為pCYB載體為pCYB載體為pCYB，形成蛋白內(nèi)含子-甲殼素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的融合蛋白第44頁/共56頁tRNA接到的非天然氨基酸摻入4.1將目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因重組入可用于體外轉(zhuǎn)錄的載體中4.2利用寡核苷酸介導(dǎo)的位點特異性突變，將特定氨基酸的密碼子突變?yōu)闊o義密碼（TAG）4.3利用runoff轉(zhuǎn)錄或化學(xué)/酶法反密碼子環(huán)取代法合成相應(yīng)的校正tRNA，將氨基酸連接在校正tRNA上4.4通過體外轉(zhuǎn)錄體系，產(chǎn)生在特定位點突變成UAG的mRNA，4.5通過體外反以體系，將非天然氨基酸摻入到蛋白質(zhì)分子中的特定位點第45頁/共56頁外源蛋白表達(dá)體系原核表達(dá)體系：大腸桿菌真核表達(dá)體系：酵母、昆蟲、哺乳動物第46頁/共56頁原核表達(dá)體系是外源基因表達(dá)的首選體系，只有在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物由于不能正確折疊或缺少翻譯后修飾而沒有生物活性，或當(dāng)天然蛋白質(zhì)的回收率太低時，才考慮選擇其它表達(dá)體系。優(yōu)點：遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚；容易培養(yǎng)，高密度發(fā)酵；缺點：①沒有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能②沒有真核翻譯后加工的功能③表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會在細(xì)菌內(nèi)聚集成包涵體第47頁/共56頁如何改善外源蛋白的溶解性？外源蛋白的分泌表達(dá)細(xì)菌生長溫度：改善在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)蛋白溶解性的最簡單方法是在誘導(dǎo)過程中降低工程菌的生長溫度（降低到30度或更低）；通過用較弱的啟動子減慢蛋白合成速率或利用部分誘導(dǎo)條件也可防止蛋白的錯折疊和聚集，而使大量可溶蛋白積累。外源蛋白與分子伴侶和折疊酶共表達(dá)外源蛋白與相關(guān)蛋白或蛋白標(biāo)簽融合：如與硫氧環(huán)蛋白、His6標(biāo)簽等功表達(dá)可以增加外源蛋白的溶解性。第48頁/共56頁酵母表達(dá)體系表達(dá)載體：Yep（酵母附加體質(zhì)粒）和YCp（酵母著絲點質(zhì)粒），二者都含有促進(jìn)在酵母中自主復(fù)制的序列，或ARS序列元件。是多拷貝質(zhì)粒甲醇酵母系統(tǒng)第49頁/共56頁外源蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中可以在蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的作用下形成正確的二硫鍵。在酵母細(xì)胞中可以產(chǎn)生N-和O-連接的糖基化，從而糖組分與蛋白質(zhì)分子共價相連。第50頁/共56頁哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。第51頁/共56頁哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染病毒載體是以病毒顆粒的方式，通過病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的相互作用使外