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文檔簡介

第四課哺乳動物總RNA提取及RNA瓊脂糖凝膠電泳第一部分哺乳動物總RNA提取實驗原理異硫氰酸胍可將哺乳動物組織勻漿中蛋白質(zhì)變性，十二烷基肌氨酸鈉可使細(xì)胞裂解，并釋放RNA，同時保持RAN的完整。苯酚也是蛋白質(zhì)變性劑，加入氯仿后離心，溶液分為水相和有機相。酸性條件下DNA同蛋白質(zhì)一起變性被離心下來，絕大部分RNA則保留于水相。水相的RNA可經(jīng)異丙醇沉淀。實驗步驟取3克組織，加30ml裂解液，勻漿。吸取500ul勻漿液于1.5ml微量離心管中.加50ul2M醋酸納（pH4.0），500ul水飽和苯酚，100ul氯仿，震蕩1分鐘。冰上放置15分鐘。13000rpm，4℃，5分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml無酶微量離心管中，加等體積的苯酚/氯仿（1:1），震蕩1分鐘。13000rpm，4℃，5分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml無酶微量離心管中，加等體積的氯仿，震蕩1分鐘。13000rpm，4℃，5分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml無酶微量離心管中，加等體積的異丙醇。0℃放置20分鐘。13000rpm，4℃，10分鐘。去上清。用1ml75%乙醇洗管壁。盡量去處乙醇。室溫干燥。將RNA沉淀溶于10ul經(jīng)DEPC處理的去離子水中。-20℃保存。第二部分RNA瓊脂糖凝膠電泳實驗原理常用的變性劑甲醛或戊二醛可使蛋白質(zhì)變性，也可破壞RNA分子的二、三級結(jié)構(gòu)。因此在含有變性劑的瓊脂糖凝膠中電泳，可防止RNA被降解，同時可以避免RNA高級結(jié)構(gòu)對電泳結(jié)果的影響。實驗試劑瓊脂糖10XMOPS（嗎啉代丙烷磺酸）(0.2MMOPS,50mMNaAc,10mMEDTA,Ph7.0)37%甲醛RNA上樣緩沖液（50%甲酰胺，1XMOPS，6%甲醛，7%甘油，0.3%溴酚藍(lán)）思考題如何處理玻璃器皿及金屬器械，使之無RNA酶？如何配制DEPC水？如何配制無RNA酶試劑？在提取RNA的實驗中，你認(rèn)為操作上應(yīng)注意那些地方能有助于防止RNA降解？在提取RNA

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