熒光定量PCR技術(shù)講座20110525XYY課件

實(shí)時(shí)熒光定量PCR

(RealtimeQuantitativePCR)RealtimeQuantitativePCRPCR：

偉大的天才發(fā)明UseofLSDSynthesisandself-testingofnovelpsychoactivesubstancesBeliefinastrologyPCR：理想與現(xiàn)實(shí)起點(diǎn)定量終點(diǎn)定量起點(diǎn)定量檢測(cè)：

--起點(diǎn)量是樣本中未經(jīng)PCR放大之前的模板量--具有重現(xiàn)性，誤差小--“加入了500個(gè)拷貝”終點(diǎn)定量檢測(cè)：-終點(diǎn)產(chǎn)物量經(jīng)過PCR放大的DNA量--不恒定，誤差大--“生成了500，0000，0000個(gè)拷貝”Real-timePCR:

檢測(cè)原理非特異性熒光標(biāo)記：

SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記：水解探針：

TaqMan非水解探針：Molecularbeacon

RQReporterQuencherRQ5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitationSYBRGreenI是一種與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料。SYBRGreenI只與雙鏈DNA結(jié)合才能發(fā)出熒光。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系中所有雙鏈DNA分子成正比。SYBRGreenI工作原理

Taqman工作原理

在退火過程中，探針與靶序列結(jié)合探針被Taq酶的5’-3’

外切酶活性剪切成片斷游離報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光在延伸過程中，探針部分與靶序列分離熒光信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子成正比。Real-timePCR

應(yīng)用基因表達(dá)分析--相對(duì)定量：基因表達(dá)量的差異--絕對(duì)定量：樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）基因型分析--SNP檢測(cè)等位基因檢測(cè)甲基化檢測(cè)

基因表達(dá)分析檢測(cè)

testsample處理樣本targetgene目的基因referencegene內(nèi)參基因totalRNAcDNAtotalRNAcDNAcalibratorsample對(duì)照樣本targetgene目的基因referencegene內(nèi)參基因qPCRqPCR以各自樣本中內(nèi)參基因?yàn)闃?biāo)桿，比較兩樣本中目的基因的相對(duì)豐度。數(shù)據(jù)分析基因表達(dá)分析檢測(cè)內(nèi)參基因(housekeepinggene)選擇樣本處理與RNA提取–cDNA–qPCRHousekeepingGene

康為產(chǎn)品不同豐度：高豐度

ACTB、GAPDH中等豐度

beta2M低豐度

HPRT1不同物種：人、大鼠、小鼠、豬、牛、羊、雞、斑馬魚、甘蔗等基因表達(dá)分析檢測(cè)樣本處理與RNA提取–cDNA–qPCR內(nèi)參基因(housekeepinggene)選擇樣本處理與RNA提取外界刺激

–

10分鐘

–

可檢測(cè)的表達(dá)改變樣品離開定義環(huán)境–

2分鐘內(nèi)

–固定、裂解細(xì)胞RNA樣本保存液Trizol超純RNA提取試劑盒RNA的評(píng)價(jià)與鑒定

-完整性

-純度小心DNA污染！-使用DNaseⅠ-引物設(shè)計(jì)

-以RNA作PCR陰性對(duì)照

CW0580

CW0592

CW0581

CW2090A

逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄引物選擇下游應(yīng)用：是否檢測(cè)其它基因？AbundantRNA的干擾：mRNAortotalRNA？檢測(cè)靈敏度是否足夠？逆轉(zhuǎn)錄酶SuperRT逆轉(zhuǎn)錄酶（RNaseH-）HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（RNaseH-）引物特異性反應(yīng)效率OligodT中低Randomhexmer低中Specificprimer高高

CW0741

CW0743總原則與普通PCR相同：避免引物二聚體，避免二級(jí)結(jié)構(gòu)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度（80–300bp)推薦做跨intron設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)原則EXON1EXON2INTRON2DNAEXON1EXON2RNA反應(yīng)條件優(yōu)化內(nèi)參基因–

目的基因

--擴(kuò)增曲線：Ct值--融解曲線：?jiǎn)我惶禺愋援a(chǎn)物--標(biāo)準(zhǔn)曲線：擴(kuò)增效率盡量高，目的基因盡可能接近內(nèi)參基因反應(yīng)條件優(yōu)化融解曲線分析--單一特異性產(chǎn)物

將溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)

圖2Effciencyslope內(nèi)參基因100%-3.32目的基因Primer278%-4.00

圖1Effciencyslope內(nèi)參基因100%-3.32目的基因Primer195.36%-3.43標(biāo)準(zhǔn)曲線分析--擴(kuò)增效率盡量高--目的基因盡可能接近內(nèi)參基因

10%以內(nèi)反應(yīng)條件優(yōu)化MasterMix的應(yīng)用--熱啟動(dòng)酶化學(xué)修飾，常溫下完全沒有聚合酶活性，熱復(fù)活需95℃10分鐘

--GoldStar、HotStar非化學(xué)修飾（Oligo修飾、抗體修飾、Mg2+螯合物）熱復(fù)活僅需95℃幾十秒--FastStar--Buffer反應(yīng)增強(qiáng)劑

--減少引物二聚體，進(jìn)一步提高反應(yīng)特異性

--對(duì)于復(fù)雜模板，提高反應(yīng)效率穩(wěn)定劑--dNTP

誤差控制使用Mastermix配置預(yù)混體系設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（不同個(gè)體）技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔）陰性對(duì)照

熒光定量PCR體系2-ΔΔCt法滿足條件：1）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率接近-正負(fù)10%2）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率基本為90%-110%

相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析1、目標(biāo)基因的CT值-內(nèi)參基因的CT值2、待測(cè)樣本的ΔCT值-對(duì)照樣本的ΔCT值3、計(jì)算表達(dá)水平比率：2–ΔΔCT=表達(dá)量的比值2-△△Ct

法

目的基因內(nèi)參基因目的基因-內(nèi)參基因△Ct待測(cè)樣本-對(duì)照樣本△△Ct倍數(shù)值fold2-△△Ct

對(duì)照樣本30.48523.6256.8601待測(cè)樣本27.02522.664.365-2.4955.63728熒光定量產(chǎn)品--染料法

某其它品牌

康為UltraSYBR-cDNA用內(nèi)參actin引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物片段100bp。-模板濃度進(jìn)行10倍稀釋，稀釋6個(gè)梯度。

康為世紀(jì)產(chǎn)品RNA--Trizol--超純RNA提取試劑盒--動(dòng)物組織RNA--植物RNA--血液RNA--病毒RNA

逆轉(zhuǎn)錄--SuperRT/HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶--cDNA第一鏈合成試劑盒--RT-PCR一步法、兩步法試劑盒熒光定量PCR--UltraSYBRMixture--FastSYBRMixture--GoldStarTaqmanMixturePCR--GoldStarDNAPolymerase--Taq/EsTaqDNAPolymerase--Taq/EsTaqMasterMixqPCR反應(yīng)優(yōu)化

外包服務(wù)Housekeepinggene–引物序列？反應(yīng)條件？目標(biāo)基因–引物序列？反應(yīng)條件？選擇試劑，摸索條件，優(yōu)化參數(shù)–兩個(gè)月？CoWin解決方案一：Primerassay客戶指定：物種，housekeepinggene，目標(biāo)基因客戶得到：經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化、驗(yàn)證過的引物，反應(yīng)條件參數(shù)，Ma