人工染色體課件

第六章人工染色體生物體的許多重要性狀牽涉到復(fù)雜的生理生化反應(yīng)系列，受多基因或基因簇的控制，與成百至上萬千堿基的DNA片段相關(guān)。復(fù)雜基因組的物理作圖和基因的定位克隆也涉及到大片段DNA的研究。因此，提高載體的容納量一直是克隆載體的重要發(fā)展方向之一。隨著脈沖電泳技術(shù)的發(fā)展以及基因組研究的日益深入，對可插入大片段DNA的克隆載體——人工染色體的研究取得了迅速的發(fā)展所謂人工染色體——是一類能在生物細(xì)胞中獨立“穩(wěn)定存在和遺傳的人工重組DNA分子”。一、YAC的基本序列元件酵母染色體DNA自主復(fù)制順序（ARS）酵母染色體的著絲粒順序（CEN）酵母染色體的端粒順序（TEL）第一節(jié)YAC——酵母人工染色體YAC載體主要是用來構(gòu)建大片段DNA文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。

正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲端粒（tel）定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)酵母自主復(fù)制序列（ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必需的信號。

酵母著絲點(CEN)有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個細(xì)胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。pYAC4：酵母第四條染色體的著絲粒。由于酵母的染色體是線狀的，因此其在工作狀態(tài)也是線狀的。但是，為了方便制備YAC載體，YAC載體以環(huán)狀的方式存在，并增加了普通大腸桿菌質(zhì)粒載體的復(fù)制元件和選擇標(biāo)記，以便保存和增殖。二、克隆策略三、YAC克隆系統(tǒng)的特點1、YAC作為可提供大片段DNA的方法，簡化了構(gòu)建染色體延伸區(qū)域圖譜和分離完整基因的過程（200～500kb，甚至1000kb）2、用酵母為宿主重新構(gòu)建大的人類基因區(qū)段，可將小的重疊的YAC變成一個大的YAC3、酵母作為一種真核生物，為其它真核的DNA提供了更合適的環(huán)境四、YAC克隆系統(tǒng)的缺點首先，在YAC載體的插入片段會出現(xiàn)缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）的現(xiàn)象。其次，容易形成嵌合體。嵌合就是在單個YAC中的插入片段由2個或多個的獨立基因組片段連接組成。嵌合克隆約占總克隆的5%～50%。

YAC染色體與宿主細(xì)胞的染色體大小相近，影響了YAC載體的廣泛應(yīng)用。YAC染色體一旦進(jìn)入釀酒酵母細(xì)胞，由于其大小與內(nèi)源的染色體的大小相近，就很難從中分離出來，不利于進(jìn)一步分析。返回第二節(jié)細(xì)菌人工染色體（BAC）一、BAC特點1、是以大腸桿菌的F因子的重要位點及基因為主體的高通量低拷貝的質(zhì)粒載體。2、F因子的特點又稱致育因子，是一個100kb的質(zhì)粒，能整合到宿主染色體中。并能高頻率的轉(zhuǎn)移遺傳標(biāo)記。F因子在大腸桿菌中的復(fù)制受到嚴(yán)格控制而保持低拷貝，一般為每細(xì)胞1～2個拷貝，其parB基因能夠排斥細(xì)胞中的外源性F質(zhì)粒，限制了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒分子間的重排，降低了BAC中外源基因的重組和嵌合度二、BAC載體的結(jié)構(gòu)1992年Shizuya利用F因子的復(fù)制起點和氯霉素抗性標(biāo)記基因，在F質(zhì)粒（pMBO131）基礎(chǔ)上構(gòu)建了第一代BAC人工染色體。能夠克隆和保持大于100kb的DNA。新一代BAC載體為7.4kb的環(huán)狀質(zhì)粒：F因子的parA，parB，parC基因以保證低拷貝的BAC質(zhì)粒在大腸桿菌分裂時均勻分配到子代細(xì)胞

oriS基因：來源于大腸桿菌F因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子解旋酶基因－repE：一個易于DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動的解旋酶選擇標(biāo)志基因Cmr－氯霉素抗性基因cosN—來源于λphage的cos位點，可以用λ末端酶切割BAC使之線性化NotⅠ識別序列，位點十分稀少。重組子通過NotⅠ消化后，可以得到完整的插入片段。用相應(yīng)的酶作不完全酶切，可以獲得長度不等的DNA片段人工合成的進(jìn)行末端標(biāo)記的含有l(wèi)oxP序列的片段Cre酶識別loxP位點后形成的線性化的BACDNA經(jīng)PFGE電泳后進(jìn)行放射自顯影，含有標(biāo)記的loxP序列的片段會有條帶利用Cre/loxP直接構(gòu)建外源基因的限制酶譜三、BAC優(yōu)點BAC載體的容載能力一般為100～350kb以大腸桿菌為寄主，轉(zhuǎn)化率高，構(gòu)建ＢＡＣ文庫比ＹＡＣ文庫更容易ＢＡＣ載體以環(huán)型超螺旋狀態(tài)存在，BAC載體空載時大小約7.5kb，在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式復(fù)制，具有一個氯霉素抗性基因。外源基因組DNA片段可以通過酶切、連接克隆到BAC載體多克隆位點上，通過電穿孔的方法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌重組缺陷型菌株。裝載外源DNA后的重組質(zhì)粒通過氯霉素抗性和LacZ基因的α–互補(bǔ)篩選。ＢＡＣ的復(fù)制子來源于Ｆ因子，可穩(wěn)定遺傳，嵌合及重組現(xiàn)象少可以通過菌落原位雜交來篩選目的基因，方便快捷ＢＡＣ載體在克隆位點的兩側(cè)具有Ｔ7和Ｓｐ6聚合酶啟動子，可以用于轉(zhuǎn)錄獲得ＲＮＡ探針或直接用于插入片段的末端測序P1噬菌體與λ噬菌體一樣，外有蛋白質(zhì)殼。內(nèi)含相當(dāng)大的（110～115kb）線性DNA，并在體外包裝于P1殼內(nèi)。P1進(jìn)入宿主細(xì)胞后環(huán)化，擴(kuò)增。1994年，有人將P1和F因子克隆結(jié)合產(chǎn)生P1人工染色體克隆系統(tǒng)-----PAC。第三節(jié)其他的人工染色體一、P1人工染色體克隆系統(tǒng)-----PAC基于PAC的人類基因組文庫插入片段的大小在60kb～150kb之間。（2）自下而上的策略該策略是在細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外將著絲粒ＤＮＡ、端粒ＤＮＡ以及復(fù)制起點裝配在一起，從而構(gòu)建HAC。研究者應(yīng)用這種策略，在ＨＴ1080細(xì)胞中得到了第一種ＨＡＣ。他們將>1Ｍｂ的人17號染色體的α衛(wèi)星ＤＮＡ、人端粒ＤＮＡ、人基因組ＤＮＡ隨機(jī)片段用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染ＨＴ1080細(xì)胞。經(jīng)過重組，那些同時含有著絲粒、端粒、復(fù)制起點且按照正常染色體結(jié)構(gòu)順序的重組連接產(chǎn)物以染色體的形式穩(wěn)定保存下來，而那些不完整或未按照正常順序連接的產(chǎn)物因其不能穩(wěn)定地進(jìn)行有絲分裂而丟失、降解。由此通過有絲分裂而自然篩選出ＨＡＣ。質(zhì)粒受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8kbpUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosom