DNA的復(fù)制修復(fù)與重組DNA技術(shù)課件

第十二章DNA的復(fù)制、修復(fù)與重組轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制遺傳信息的傳遞遺傳信息的表達(dá)

分子生物學(xué)中心法則(centraldogma)1958年Crick

1970年Temin和Baltimore

DNARNA蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制一、半保留復(fù)制定義：親代DNA分子的兩條鏈可以分別作為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，指導(dǎo)DNA新鏈的合成。新合成的兩個(gè)子代DNA分子，堿基序列與親代DNA分子完全一樣，但一條鏈來(lái)自親代DNA鏈，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻腄NA鏈。二、半不連續(xù)復(fù)制5`3`3`5`3`5`5`5`3`3`5`3`3`5`定義：DNA復(fù)制時(shí)，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)復(fù)制，另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)復(fù)制，稱半不連續(xù)復(fù)制。前導(dǎo)鏈(leadingstrand)：在引物的3`端按5`

→3`方向連續(xù)不斷地合成的DNA鏈。隨從鏈(laggingstrand)：在引物的3`端按5`→3`方向不連續(xù)合成的DNA鏈。岡崎片段（Okazakifragment）：后隨鏈上不連續(xù)合成的1000～2000或100～200個(gè)核苷酸組成的DNA小片段。三、RNA引物定義：DNA復(fù)制時(shí)，子鏈5`端的一段寡聚核糖

核苷酸鏈，能為DNA聚合酶提供聚合新的脫氧核糖核苷酸所需的3`OH，最后可被切除。意義：提供新的脫氧核糖核苷酸聚合所需的3`OH保證復(fù)制起始部位的真實(shí)性3`5`DNA模板3`5`DNA模板RNA引物5`OH-3`RNA引物5`OH-3`3`引物酶（RNA聚合酶）羅杰.科恩伯格接受父親（左）的祝賀

TheNobelPrizeinChemistry2006"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription"RogerD.Kornberg羅杰.科恩伯格5`→3`外切酶活性功能：切除RNA引物切除突變片段，在DNA損傷修復(fù)中起作用5`→3`聚合酶活性

功能：填補(bǔ)片段切除后的空缺DNA聚合酶Ⅰ多功能酶Klenow片段常用的工具酶5`3`3`5`2、DNA聚合酶Ⅱ活性：5`→3`聚合酶活性3`→5`外切酶活性功能：不確切

3、DNA聚合酶Ⅲ組成：多亞基復(fù)和物全酶

核心酶（αεθ）×2

連接二聚體（τ2）

單個(gè)運(yùn)載夾鉗復(fù)合物（γ2δδ`χψ）

β4

ααττεεθθδδ`γ2ψχββββ二、真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶：α、β、γ、δ、ε五種功能：DNA聚合酶α—聚合隨從鏈DNA聚合酶δ—聚合前導(dǎo)鏈（協(xié)同增殖細(xì)胞核抗原PCNA）DNA聚合酶γ—聚合線粒體DNADNA聚合酶β、ε—校讀功能、參與DNA損傷修復(fù)三、解鏈、解旋酶類和蛋白質(zhì)（大腸桿菌E.coli）1、DNA解鏈酶

功能：解開(kāi)DNA雙鏈

條件：需要ATP供能，2個(gè)ATP/對(duì)堿基2、單鏈DNA結(jié)合蛋白

功能：維持模板單鏈狀態(tài)

保護(hù)模板不受核酸酶水解DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ功能：暫時(shí)切斷雙鏈中的一股，

另一股鏈旋轉(zhuǎn)通過(guò)該缺口，

張力下降后，再連接缺口

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ功能：暫時(shí)切斷雙鏈中的兩股，

斷端旋轉(zhuǎn)，張力下降后，再連接缺口

條件：需要ATP供能3、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶5、連接酶功能：催化兩段DNA鏈間形成3`5`磷酸二酯鍵特點(diǎn)：只能催化雙鏈DNA鏈上的一股或兩股鏈的連接5`5`3`3`5`5`3`3`3`5`5`5`5`5`3`3`3`3`第三節(jié)DNA復(fù)制過(guò)程（大腸埃希菌）模板：?jiǎn)捂淒NA引物：RNA引物原料：dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）聚合酶：DNA聚合酶輔助因子：Mg2＋其它：酶和蛋白因子方向：5`→3`一、復(fù)制的起始1、復(fù)制起始部位oriC單一：原核生物通常只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)特定：高度保守序列GATCTNTTNTTTT

DnaA結(jié)合位點(diǎn)

真核生物有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)GATCTNTTNTTTTTTATCCACADnaADnaADnaADnaA單鏈結(jié)合蛋白：穩(wěn)定并保護(hù)已解開(kāi)的DNA單鏈引物酶：RNA聚合酶，合成RNA引物維持模板單鏈狀態(tài)2、復(fù)制方向雙向復(fù)制復(fù)制眼（泡）：DNA復(fù)制時(shí)，局部解開(kāi)DNA的雙鏈，在電鏡下呈眼泡狀突起復(fù)制叉：DNA復(fù)制時(shí)，局部DNA雙鏈解開(kāi)，在復(fù)制前進(jìn)部位兩側(cè)形成的Y型或叉狀結(jié)構(gòu)真核生物DNA復(fù)制原核生物DNA復(fù)制二、復(fù)制的終止DNA聚合酶Ⅰ切除引物填補(bǔ)空缺5`3`3`3`3`5`5`5`DNA連接酶連接前后兩個(gè)片段間的缺口5`3`3`3`3`5`5`5`四、真核生物端粒DNA的復(fù)制1、端粒：真核生物線性DNA的兩個(gè)末端結(jié)構(gòu)：由數(shù)百個(gè)串聯(lián)排列的GT豐富的寡聚核苷酸序列組成人(AGGGTT)n四膜蟲(chóng)(GGGGTT)n功能：維持染色體DNA的穩(wěn)定性2、端粒酶：防止端粒縮短的一種逆轉(zhuǎn)錄酶組成：由RNA和蛋白質(zhì)組成蛋白質(zhì)—DNA聚合酶RNA—模板唯一攜帶RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄酶功能：復(fù)制端粒序列，防止端?？s短。

機(jī)制：端粒、端粒酶與腫瘤：生殖細(xì)胞、干細(xì)胞：端粒酶活性保持體細(xì)胞：端粒酶活性下降，正常衰老現(xiàn)象惡性腫瘤細(xì)胞：端粒酶的活性恢復(fù)，使細(xì)胞永生化，形成惡性增殖1994年，Couter人卵巢細(xì)胞端粒酶表達(dá)1997年，人端粒酶基因克隆85%腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性升高第四節(jié)DNA的損傷與修復(fù)一、DNA損傷的因素1、自發(fā)因素環(huán)境中溶劑分子隨即熱碰撞N-糖苷鍵斷裂，A、G脫落磷酸戊糖堿基2、物理因素紫外線電離輻射共價(jià)交聯(lián)，嘧啶二聚體單（雙）鏈斷裂，堿基脫落破壞，分子交聯(lián)，脫氧核糖破壞3、化學(xué)因素亞硝酸鹽CU二、DNA損傷的類型1、點(diǎn)突變轉(zhuǎn)換同型堿基顛換異型堿基調(diào)控序列影響基因表達(dá)編碼序列有意突變—改變蛋白質(zhì)功能

無(wú)意突變—個(gè)別氨基酸改變，蛋白質(zhì)功能不變

靜止突變—個(gè)別堿基改變，氨基酸不變鐮刀型紅細(xì)胞貧血N-Val.His.Leu.Thr.Pro.Glu.Glu…….-C

N-Val.His.Leu.Thr.Pro.Val.Glu…….-C

5`-***.***.***.***.***.CTC.***………-3`5`-***.***.***.***.***.CAC.***………-3`2、缺失一個(gè)核苷酸、一段核苷酸、一個(gè)基因Lesch-Nyhan`s綜合癥次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）基因丟失3、插入一個(gè)堿基、一段核苷酸芳香族分子等移碼突變4、倒位二、DNA損傷的修復(fù)機(jī)制1、光修復(fù)機(jī)制低等生物解聚嘧啶二聚體不需要光復(fù)活酶

需要光復(fù)活酶2、切除修復(fù)機(jī)制（暗修復(fù)）所有生物切割3`5`磷酸二酯鍵（擴(kuò)創(chuàng)）、填補(bǔ)、連接UV特異的核酸內(nèi)切酶著色性干皮病

②AP特異的核酸內(nèi)切酶③

DNA聚合酶I（5`→3`外切）PPPPOOOO5`3`④

DNA聚合酶I（5`→3`聚合）3、堿基切除修復(fù)機(jī)制①DNA糖苷酶⑤

DNA連接酶

①切割錯(cuò)誤堿基→②切割3`5`磷酸二酯鍵→③切除、填補(bǔ)→④連接DNA糖苷酶：特異識(shí)別一種DNA分子中改變的堿基，并水解該堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵,形成AP位點(diǎn)。AP特異的核酸內(nèi)切酶：切割3`5`磷酸二酯鍵DNA聚合酶I：切除損傷鏈，填補(bǔ)缺口連接酶：連接切口為什么組成DNA是ATCG，而組成RNA是AUCG？尿嘧啶-DNA糖苷酶的發(fā)現(xiàn)尿嘧啶

胸腺嘧啶5`C甲基化5`C去甲基“區(qū)分正常的尿嘧啶與胞嘧啶脫氨形成的尿嘧啶”的需要455111復(fù)制的真實(shí)性1、半保留復(fù)制2、堿基互補(bǔ)配對(duì)原則3、RNA引物4、DNA聚合酶：校讀功能5、端粒與端粒酶6、DNA的損傷修復(fù)機(jī)制7、尿嘧啶-DNA糖苷酶DNA（T）

RNA（U）第五節(jié)重組DNA技術(shù)1、DNA重組：指兩個(gè)DNA分子之間，或一個(gè)DNA分子的兩個(gè)不同部位之間，通過(guò)鏈斷裂和片段的交換重接，改變了基因的組合與序列。這種現(xiàn)象可發(fā)生在同一細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，甚至不同物種的DNA分子間。

2、DNA重組技術(shù)：在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用人工方法將不同來(lái)源的DNA分子拼接成一個(gè)重組(recombinant)DNA分子，并將其引入活細(xì)胞內(nèi)，使其大量復(fù)制或表達(dá)，這種技術(shù)稱為DNA重組技術(shù)或基因工程。3、重組DNA技術(shù)的基本步驟（1）重組分子的構(gòu)建（接）（2）引入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染感染（3）篩選（篩）（1）重組分子的構(gòu)建（接）目的基因或目的DNA片段的獲得聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）原理：模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程：94℃變性58℃退火72℃延伸條件：DNA模板：?jiǎn)捂淒NA寡聚核苷酸引物：按要求設(shè)計(jì)TaqDNA聚合酶：耐熱的DNA聚合酶輔助因子：Mg2+原料：dNTP緩沖體系：合適的反應(yīng)條件，如PH、離子強(qiáng)度載體質(zhì)粒（plasmid）：細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子，能自主復(fù)制，有抗藥性基因以便篩選。限制性內(nèi)切酶：微生物產(chǎn)生的，能識(shí)別雙鏈DNA分子中某一特異堿基順序（約4-6個(gè)堿基），并切開(kāi)磷酸二酯鍵的酶。

EcoRI回文結(jié)構(gòu)5