大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目-大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練智能管理系統(tǒng)

大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

項(xiàng)目研究成果概述項(xiàng)目名稱松材線蟲對(duì)不同松樹寄主的適生性變化研究項(xiàng)目類型指導(dǎo)項(xiàng)目資助經(jīng)費(fèi)元項(xiàng)目負(fù)責(zé)人吳思穎指導(dǎo)教師應(yīng)晨希所在學(xué)院林學(xué)院專業(yè)森林保護(hù)項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)成員陸柯言、劉彥彤、黃一萍、伏鼎一、研究?jī)?nèi)容、目的為研究松材線蟲對(duì)不同松樹寄主的適應(yīng)性的影響，本試驗(yàn)選取不同致病力的松材線蟲蟲株，通過(guò)多次接種松材線蟲至不同抗性松樹體內(nèi)，測(cè)定松樹對(duì)松材線蟲種群繁殖及其致病力的影響。結(jié)果表明，松材線蟲在抗性松樹體內(nèi)和易感松樹體內(nèi)的不斷擴(kuò)繁均會(huì)使得其種群致病力提高；松材線蟲種群性比的穩(wěn)定及種群的致病力與種群對(duì)寄主的適應(yīng)性有關(guān)。二、研究方法、過(guò)程、結(jié)果1供.試松材線蟲蟲株選擇前期經(jīng)對(duì)2年生黑松進(jìn)行致病性測(cè)定試驗(yàn)而獲得的2株分別具強(qiáng)、弱致病力的松材線蟲蟲株，采用單異活體培養(yǎng)法在灰葡萄孢（Botrytiscinerea）上25℃繼代培養(yǎng)并保存?zhèn)溆?。供試蟲株的來(lái)源與寄主見(jiàn)表1。表1供試松材線蟲的寄主、來(lái)源和致病力Tab.1Thehost,sourceandpathogenicityofthetestB.xylophilus松材線蟲對(duì)2年生黑松致病力Pathogenicity編號(hào)NO.寄主Host來(lái)源SourceZJ馬尾松(Pinusmassoniana)浙江省富陽(yáng)市病死木樣強(qiáng)YW4思茅松(Pinuskesiyalangbianensis)云南省德宏市病死木樣弱供試寄主松樹選取年生的易感寄主黑松（ b中抗寄主火炬松（ ）和來(lái)自于由江蘇林科院篩選獲得的高抗寄主馬尾松（ ）用于試驗(yàn)。其中，黑松和火炬松購(gòu)于安徽全椒林場(chǎng)，抗性馬尾松由江蘇省林科院提供。在試驗(yàn)期間置于溫室內(nèi)定期澆水，統(tǒng)一管理。.線蟲接種液的制備將單異活體培養(yǎng)的供試線蟲采用貝爾曼漏斗法分離。將線蟲收集在 的離心管中，分別用硫酸鏈霉素洗滌3次、無(wú)菌水洗滌1次進(jìn)行表面消毒。為方便計(jì)數(shù)，先根據(jù)肉眼觀察，粗略調(diào)出一個(gè)合適的濃度，定下體積，然后用微量進(jìn)樣器吸取充分混勻的線蟲懸浮液0滴成數(shù)滴在潔凈的載玻片上，置于體視顯微鏡（， ）低倍鏡下觀察計(jì)數(shù)。重復(fù)次，取平均值換算線蟲濃度及總數(shù)。.松材線蟲對(duì)不同松樹寄主的致病性測(cè)定試驗(yàn)從6月上旬至11月上旬進(jìn)行，采用人工皮接法使松材線蟲進(jìn)入不同松樹寄主體內(nèi)。具體方法為，用消毒的鋒利解剖刀在松苗莖干中下部位置由上往下割開(kāi)樹皮，深入木質(zhì)部，但不超過(guò)松苗直徑的1/。3掀開(kāi)樹皮，塞入合適大小的棉球，然后用透明膠布將樹皮和棉球包裹好，最后用微量進(jìn)樣器注入線蟲的懸浮液。接種蟲量為 條株松苗，每種松樹苗木重復(fù)次，對(duì)照接入無(wú)菌水。在接種后第、和觀察記錄松苗的發(fā)病率和感病指數(shù)。發(fā)病率和感病指數(shù)計(jì)算參考 中方法。、.不同松樹體內(nèi)松材線蟲寄生適應(yīng)性測(cè)定采用 提出的相關(guān)寄生適應(yīng)性（ b ）系數(shù)分析不同致病力的松材線蟲在種不同抗性寄主體內(nèi)的定殖、擴(kuò)張情況。 系數(shù)的計(jì)算公式為：接種后松苗死亡率X每棵死亡松苗分離線蟲平均數(shù) 。3種不同抗性的松樹和2種不同致病力的松材線蟲共組成6組接種處理，當(dāng)任一處理中松苗出現(xiàn)全部死亡時(shí)，即將所有供試松苗連根取回，去掉針葉，將枝干洗凈后用鋒利的解剖刀切成細(xì)條，貝爾曼法分離線蟲，后收集，分別統(tǒng)計(jì)種松樹體內(nèi)松材線蟲總量、雌雄蟲性比。以統(tǒng)計(jì)結(jié)果中最少的線蟲群體數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)，將各個(gè)處理所得線蟲接入灰葡萄孢擴(kuò)繁，放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)、培養(yǎng)后再次按方法接入原寄主松樹內(nèi)，重復(fù)上述步驟共次。這期間原強(qiáng)毒蟲株和弱毒蟲株在灰葡萄孢上繼代培養(yǎng)以作未接種松樹的對(duì)照。6.不同松樹體內(nèi)松材線蟲分泌的纖維素酶活性測(cè)定6.供1試線蟲和線蟲胞外纖維素酶的提取測(cè)定不同抗性寄主松樹上分離所得的松材線蟲種群分泌的纖維素活力，方法參考文獻(xiàn)［9稍］作修改，將線蟲收集后調(diào)整濃度為X,L后收集上清液，期間不時(shí)震蕩搖動(dòng)，置于℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.葡2萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取 i加 去離子水使之懸浮，邊混合邊慢慢加入氫氧化鈉溶液每去離子水中含 氫氧化鈉。將該懸浮液置于0水浴中溫?zé)嶂脸吻?，不斷混合下緩緩，加入酒石酸甲鈉至溶液中，用去離子水稀釋至 ，貯存于棕色瓶中。取 的葡萄糖溶液分別加入 號(hào)管中，每管用去離子水補(bǔ)足體積為 ，然后加 溶液，沸水浴 ，補(bǔ)足體積為 ，以號(hào)管為空白對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)（ ， ）測(cè)定 吸光度將測(cè)定得值輸 ，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及值。6.纖3維素酶活性的測(cè)定TOC\o"1-5"\h\z用法測(cè)定。反應(yīng)系統(tǒng)為 的羧甲基纖維素鈉（M國(guó)藥集團(tuán)上海）的醋酸鈉緩沖液， 酶液，經(jīng)C反應(yīng)，加溶液，置沸水浴 ，冷卻后加入去離子水使得總體積為 ，在處比色。以每分鐘每毫升酶液產(chǎn)生1微克葡萄糖的量作為1個(gè)活性單位，將測(cè)的葡萄糖含量值代入下式，求得纖維素酶活性值。 XX7.不同抗性松樹上松材線蟲的致病力變化測(cè)定將經(jīng)過(guò)3次接種不同抗性松樹上分離的松材線蟲進(jìn)行致病力測(cè)定，選取2年生黑松苗為接種對(duì)象，接種量為300條0/株，每個(gè)種群接種8株，接種后每5天觀察并記錄松樹發(fā)病情況，以持續(xù)在灰葡萄孢上繼代培養(yǎng)的強(qiáng)、弱毒蟲株作為對(duì)照。8.數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析采用 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。采用 多重比較法檢驗(yàn)各處理的差異顯著性，顯著性檢驗(yàn)水平為 。三、討論（結(jié)論）松材線蟲通過(guò)不斷侵染松樹，在寄主松樹體內(nèi)的種群性比會(huì)不斷上升并趨于穩(wěn)定，線蟲種群持續(xù)增殖，種群數(shù)量擴(kuò)增，分泌的纖維素酶活力增強(qiáng)，可以使得線蟲更好的獲得寄主體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，從而表現(xiàn)出對(duì)寄主適生性和致病力的提高。在自然環(huán)境中，松材線蟲的寄主發(fā)生轉(zhuǎn)換的可能是存在的，當(dāng)線蟲從易感寄主轉(zhuǎn)換至高抗寄主體內(nèi)時(shí)，最初種群適應(yīng)性不高，可能并不會(huì)對(duì)寄主產(chǎn)生嚴(yán)重影響，但如果這種情況持續(xù)發(fā)生，存活的線蟲種群的寄生適應(yīng)性會(huì)不斷提高，