免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

整理pptCK陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞組織來(lái)源（中間絲標(biāo)志物）整理pptEMA陽(yáng)性整理ppt腫瘤的病因和發(fā)病機(jī)理研究HBsAg陽(yáng)性（病毒及癌基因標(biāo)志物）整理ppt腫瘤細(xì)胞功能分類B細(xì)胞陽(yáng)性（淋巴瘤及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤標(biāo)志）整理ppt腫瘤癌前病變和早期診斷P53陽(yáng)性（癌胚抗原或腫瘤相關(guān)抗原）整理ppt腫瘤病理診斷與鑒別診斷HMB45陽(yáng)性（各種腫瘤特異性抗原）整理ppt腫瘤治療和預(yù)后判斷PR陽(yáng)性（性激素受體，癌基因和細(xì)胞增殖活性標(biāo)志）整理pptCer-bB-2整理pptKi-67陽(yáng)性整理ppt

第一節(jié)基本原理

整理ppt抗原＋抗體（特異性）＋酶標(biāo)記抗體，通過(guò)酶與底物作用生成有色反應(yīng)物，定位組織或細(xì)胞內(nèi)抗原的一門(mén)技術(shù)。整理ppt免疫酶組化免疫學(xué)(抗原抗體反應(yīng))

酶細(xì)胞化學(xué)(底物顯色反應(yīng))+特異性敏感性定位性可視性整理pptPAP法整理ppt免疫酶組織化學(xué)基本組成：抗原↓抗體↓放大系統(tǒng)↓顯色系統(tǒng)整理pptABC法整理ppt免疫酶特點(diǎn)：信號(hào)定位準(zhǔn)確標(biāo)本可長(zhǎng)期保存陽(yáng)性標(biāo)記與病變關(guān)系方法簡(jiǎn)便，易推廣整理ppt第二節(jié)酶和底物整理ppt一、酶及其特點(diǎn)酶選擇標(biāo)準(zhǔn)：

★該酶用細(xì)胞化學(xué)易于被檢出，能被光鏡或電鏡觀察。

★酶反應(yīng)產(chǎn)物須穩(wěn)定，不擴(kuò)散，具有良好定位。整理ppt

★酶易于純化，獲得純制品。

★酶與免疫球蛋白結(jié)合后，不喪失其活性。整理ppt

★酶在PH中性液內(nèi)較穩(wěn)定。★組織中不應(yīng)存在與底物作用的內(nèi)源性酶。整理ppt符合上述條件：

辣根過(guò)氧化物酶鹼性磷酸酶葡萄糖氧化酶整理ppt（一）辣根過(guò)氧化物酶（HRP）★分子量（40000），不會(huì)遮蓋抗原的結(jié)合部位★穩(wěn)定，易獲得較高純度酶★具有較高活性及特異性整理ppt★可溶性佳，生成的產(chǎn)物不擴(kuò)散★組織中內(nèi)源性酶較少★可作用于多種底物，產(chǎn)生不同顏色★HRP穿透力強(qiáng)，易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)整理ppt（二）鹼性磷酸酶（AKP）從小牛腸粘膜或大腸桿菌中提取

●組織穿透能力較弱

●內(nèi)源性AKP較高

●左旋咪唑具有抑制作用整理ppt（三）葡萄糖氧化酶（GOD）底物為葡萄糖，終產(chǎn)物穩(wěn)定

●體內(nèi)無(wú)內(nèi)源性GOD

●分子量大，穿透力較弱整理ppt二、底物及其特點(diǎn)酶＋底物→酶·底物→酶＋產(chǎn)物（顯色）整理pptHRP的底物：HRP的底物為低濃度的H2O2，供氫體為胺類及酚類化合物。整理pptHRP顯色反應(yīng)：HRP＋H2O2HRP＋H2O＋電子供體（氧化型）電子供體整理ppt電子供體被氧化后，迅速改變顏色，通過(guò)聚合等反應(yīng)，生成不溶性有色顆粒，并就地原位沉淀。整理pptHRP常用的電子供體：●3.3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)～棕色●氨乙基卡巴唑(AEC)～紅色，易溶于有機(jī)溶劑，易擴(kuò)散，用水溶性封固劑。整理ppt●4-氯-1-茶酚（4CN）～藍(lán)色，易彌散，不能久保存●3.3，5.5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)～黃色整理pptAKP底物：AKP常用的底物為α-萘酚AS-B1磷酸鹽偶聯(lián)試劑：固蘭BB～藍(lán)色固紅TR～紅色整理ppt第三節(jié)酶標(biāo)記抗體法整理ppt酶標(biāo)記抗體法（EnzaymeLabelledantibody）是將酶通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合在抗體分子上，制備成酶標(biāo)記抗體，通過(guò)抗體去尋找相應(yīng)抗原。整理ppt一、直接法原理：HRP標(biāo)記在特異性抗體（第一抗體）上，抗原---抗體●HRP復(fù)合物整理ppt組織抗原第一抗體過(guò)氧化物酶直接法整理ppt步驟：一步完成特點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便、省時(shí)，專一性強(qiáng)，非特異染色輕，但敏感性差，一種標(biāo)記抗體只能檢測(cè)一種抗原。整理ppt二、間接法原理：HRP標(biāo)記在第二抗體上，抗原---特異性抗體---第二抗體●

HRP復(fù)合物步驟：二步法整理ppt組織抗原第一抗原第二抗體過(guò)氧化物酶間接法整理ppt特點(diǎn)：敏感性較直接法高，一種標(biāo)記抗體能用于相應(yīng)動(dòng)物制備的多種特異性抗體，檢測(cè)多種抗原。但較直接法費(fèi)時(shí)，非特異染色稍重。整理ppt第四節(jié)酶抗酶法

整理ppt●制備抗酶抗體●制備PAP復(fù)合物整理ppt酶橋法組織抗原第一抗體第二抗體第三抗體（抗酶抗體）HRP整理ppt一、PAP法原理：抗原---特異性抗體---第二抗體（橋抗體）---PAP復(fù)合物步驟：三步法整理ppt組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物PAP法HRP整理ppt特點(diǎn)：

敏感性較高，背景染色較輕但特異性抗體與PAP必須為同一種屬動(dòng)物整理ppt二、雙PAP法：原理：在PAP的基礎(chǔ)上再重復(fù)第二抗體和PAP復(fù)合物整理ppt抗原---特異性抗體---第二抗體（橋抗體）---PAP---第二抗體---PAP復(fù)合物整理ppt組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物雙PAP法HRP整理ppt雙PAP法組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物HRP整理ppt步驟：五步法特點(diǎn)：敏感性較高缺點(diǎn)：但步驟多，費(fèi)時(shí)，非特異背景重整理ppt三、APAAP法原理：抗原---特異抗體---第二抗體---APAAP復(fù)合物步驟：三步法整理pptAPAAP法整理ppt特點(diǎn)：非特異背景較輕，不受內(nèi)源性酶的干擾。但產(chǎn)物易溶于有機(jī)溶劑整理ppt第五節(jié)卵白素---生物素法

整理pptAvidin為一種鹼性糖蛋白，由四個(gè)相同亞基組成Biotin小分子維生素Avidin和Biotin具有較高親和力整理ppt一、ABC法AvidinBiotinComplex原理：酶標(biāo)記Biotin形成酶素化Biotin整理ppt酶素化Biotin＋Avidin---ABC復(fù)合物抗原---特異抗體---Biotin標(biāo)記第二抗---Avidin●Biotin●HRP整理ppt組織抗原第一抗體第二抗體HRP生物素卵白素ABC法整理ppt步驟：三步法特點(diǎn)：敏感性較高，特異性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣整理ppt

●某些臟器存在內(nèi)源性生物素干擾●Avidin與核酸及細(xì)胞膜中磷脂有非特異反應(yīng)整理pptSABC法StreptavidinbiotinPeroxidaseComplexSABC法已代替ABC法整理ppt二、LSAB法LabelledStreptavidinBiotinMethod原理：●

Biotin標(biāo)記第二抗體整理pptLSAB法整理ppt●HRP標(biāo)記Avidin抗原---特異性抗體---Biotin標(biāo)記第二抗體---Avidin●HRP復(fù)合物整理ppt步驟：三步法特點(diǎn)：敏感性高，特異性強(qiáng)，方法簡(jiǎn)便整理ppt第六節(jié)多聚合物酶法整理ppt多聚合物酶法整理ppt

HRP---多聚合物---抗體

一、Epos法Enhancedpolymerone-stepstaining整理ppt組織抗原一抗HRP多聚骨架EPOS方法整理ppt原理：采用一種具有惰性的多聚化合物作為骨架，將特異性抗體和HRP，同時(shí)標(biāo)記在多聚合物分子上，形成HRP---多聚合物---特異性抗體。整理ppt步驟：一步法特點(diǎn)：快速，簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，敏感性高但商品化種類不全，價(jià)格昂貴整理ppt二、EnVision法EnhancedLabelledPolymerSystem原理：HRP---多聚合物---第二抗體整理ppt組織抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步第二步EnVisionTM方法整理ppt特點(diǎn)：敏感性高：（1mole復(fù)合物中含70moleHRP和10mole第二抗體）整理ppt特異性強(qiáng)：復(fù)合物內(nèi)無(wú)內(nèi)源性Avidin和Biotin的干擾。整理ppt第七節(jié)基本操作步驟整理ppt＊抗原修復(fù)＊內(nèi)源性過(guò)氧化物抑制＊正常血清封閉＊第一抗體整理ppt＊第二抗體＊酶標(biāo)記體＊DAB-H2O2顯色整理ppt第八節(jié)抗原定位及非特異染色

整理ppt組織細(xì)胞

＊固定問(wèn)題

＊脫蠟不徹底

＊內(nèi)源性過(guò)氧化物

＊內(nèi)源性生物素整理ppt抗原

＊抗原彌散

＊抗原異常表達(dá)

＊共同抗原決定簇整理ppt特異性抗體

＊非特異吸附

＊抗體不純

＊交叉反應(yīng)整理ppt第二抗體

＊IgG交叉反應(yīng)

＊二抗不純整理ppt標(biāo)記物

＊質(zhì)量

＊純度

＊標(biāo)記水平整理ppt底物溶液

＊

DAB