病毒培養(yǎng)技術(shù)

病毒培養(yǎng)技術(shù)第1頁(yè)/共28頁(yè)病毒增殖技術(shù)第2頁(yè)/共28頁(yè)動(dòng)物增殖病毒技術(shù)禽胚增殖病毒技術(shù)細(xì)胞增殖病毒技術(shù)第3頁(yè)/共28頁(yè)一、動(dòng)物增殖病毒技術(shù)

選擇動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)：①大動(dòng)物應(yīng)來(lái)源于非疫區(qū)，最好是未接種過(guò)相應(yīng)病毒疫苗、青壯年和健康(經(jīng)臨床檢查、檢疫)；②對(duì)相應(yīng)病毒易感，并十分敏感；③經(jīng)隔離飼養(yǎng)和觀察檢查證明健康；④家兔、小鼠、大鼠等應(yīng)符合普通級(jí)或清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)；雞應(yīng)屬非免疫雞或SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；犬和貓應(yīng)品種明確，并符合普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)；⑤體重、年齡要基本一致，個(gè)體差別不宜過(guò)大。

第4頁(yè)/共28頁(yè)二、禽胚增殖病毒技術(shù)（一）禽胚的選擇

SPF雞胚據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)22種特定病原體非免疫雞胚應(yīng)無(wú)特定病原的母源抗體，普通雞胚可能帶有雞的多種病原體，不適用于疫苗生產(chǎn)異源性性疫苗：鴨胚和鴿胚第5頁(yè)/共28頁(yè)（二）禽胚接種途徑與收獲

絨毛尿囊膜接種法尿囊腔接種法卵黃囊接種法羊膜腔接種法靜脈接種法腦內(nèi)接種法第6頁(yè)/共28頁(yè)雞胚絨毛尿囊膜接種法

第7頁(yè)/共28頁(yè)尿囊腔接種法

第8頁(yè)/共28頁(yè)尿囊液收獲方法

第9頁(yè)/共28頁(yè)雞胚卵黃囊接種法第10頁(yè)/共28頁(yè)1．種蛋質(zhì)量①病原微生物：垂直傳遞，如白血病、腦脊髓炎、腺病毒、支原體及傳染性貧血因子等。②母源抗體：③抗生素：立克次氏體和鸚鵡熱衣原體2．孵化技術(shù)①溫度：37～39.5℃。傳染性支氣管炎病毒37℃②濕度：雞胚53％～57％，水禽胚比雞胚高5％～10％。③通風(fēng)：氧氣，二氧化碳。④翻蛋：（三）影響禽胚增殖病毒的因素第11頁(yè)/共28頁(yè)3．接種技術(shù)

不同病毒的增殖有不同的接種途徑，同一種病毒接種不同日齡禽胚獲得的病毒量也不同。接種日齡：雞胚13～14日齡。鴨胚15～16日齡，尿囊液含量最高，平均約6～8ml，羊水約1～2ml。接種部位：不應(yīng)傷及胚體和血管，以免影響其發(fā)育嚴(yán)格防止禽胚污染

①雞胚接種時(shí)嚴(yán)格無(wú)菌操作；

②定期清掃消毒孵化室，保持室內(nèi)空氣新鮮；

③種蛋入孵前先用溫水清洗，消毒，涼干。第12頁(yè)/共28頁(yè)三、細(xì)胞增殖病毒技術(shù)

1．細(xì)胞培養(yǎng)的概念

細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使動(dòng)物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至2～4個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞分類：根據(jù)細(xì)胞染色體和繁殖特性原代細(xì)胞(primarycell)

細(xì)胞株(cellstrain)

傳代細(xì)胞（continuedcellline）

細(xì)胞系(cellline)第13頁(yè)/共28頁(yè)（1）原代細(xì)胞(primarycell)

指由新鮮組織經(jīng)剪碎和胰酶消化制備的細(xì)胞，如CEF細(xì)胞。（2）細(xì)胞株(cellstrain)又稱二倍體細(xì)胞指自繼代培養(yǎng)的細(xì)胞中選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標(biāo)記的細(xì)胞。這類細(xì)胞且能保持原來(lái)的二倍染色體數(shù)目，能連續(xù)傳很多代(50～100代)，但為有限生命；沒(méi)有腫瘤原。如PKl5、BHK21和Vero（3）傳代細(xì)胞（continuedcellline）\

細(xì)胞系(cellline)

能在體外無(wú)限傳代，應(yīng)用方便，其染色體數(shù)目及增殖特性均類似于惡性腫瘤細(xì)胞，且多來(lái)源于癌細(xì)胞，如HeLa細(xì)胞系

第14頁(yè)/共28頁(yè)

靜置培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)(suspensioncellculture)微載體培養(yǎng)(microcarriercellculture)

中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)(hollowfibrecellculture)

微囊化細(xì)胞培養(yǎng)2．細(xì)胞培養(yǎng)方法第15頁(yè)/共28頁(yè)懸浮培養(yǎng)通過(guò)振蕩或轉(zhuǎn)動(dòng)裝置使細(xì)胞始終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法，主要用于一些在振蕩或攪拌下能生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞，如生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。微載體培養(yǎng)微載體直徑應(yīng)為60～105nm，無(wú)毒性，透明，顆粒密度與培養(yǎng)液密度相近似，略重于液體，低速攪拌即能懸浮，不吸收培養(yǎng)液和化學(xué)反應(yīng)，表面光滑、硬度小、有彈性，易于細(xì)胞吸附在表面，如DEAE—SephadexA-50、Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3等。微載體培養(yǎng)的容器為特制的生物反應(yīng)器，有自動(dòng)化裝置。細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)106～107個(gè)/m1，每升培養(yǎng)液可加微載體2～5g，每克有8000～9000個(gè)珠子，培養(yǎng)面積約為2～5萬(wàn)cm2，比常規(guī)培養(yǎng)面積大10～25倍。第16頁(yè)/共28頁(yè)中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)(hollowfibrecellculture)

組成:中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動(dòng)泵中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯－丙烯復(fù)合物或多聚碳酸硅等材料制成，外徑50~100μm，壁厚25~75μm，壁呈海綿狀，上面有很多微孔。中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物出入，而對(duì)細(xì)胞和大分子物質(zhì)（如單克隆抗體）有滯留作用。培養(yǎng)液能有效地分布，細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間可達(dá)數(shù)月，保持高度活性，培養(yǎng)的細(xì)胞密度大，細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)濃度高，純度可達(dá)60％～90％；占用空間小，適于各類細(xì)胞，但設(shè)備昂貴。第17頁(yè)/共28頁(yè)培養(yǎng)液血清細(xì)胞接種量pH溫度無(wú)菌條件培養(yǎng)器皿清潔度3.細(xì)胞培養(yǎng)要素RPMI-1640、199、DMEM、F12

第18頁(yè)/共28頁(yè)

血清成分：必需氨基酸、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和貼壁的成分。α-珠蛋白和白蛋白能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、a2-球蛋白和β脂蛋白G2能促進(jìn)細(xì)胞貼壁。血清選擇：同種動(dòng)物優(yōu)于異種動(dòng)物血清；人和牛血清優(yōu)于馬血清；馬血清優(yōu)于兔血清和雞血清。血清使用：目前國(guó)內(nèi)多用犢牛血清，使用前須經(jīng)56℃滅活30min，并進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。生長(zhǎng)液血清含量一般為5％～20％。維持液中血清量為0%～5％。血清替代因子：激素和生長(zhǎng)因子（如胰島素、上皮生長(zhǎng)因子）、結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白）、貼壁因子（如魚精蛋白、聚賴氨酸）和微量元素（如硒）四類幾十種，多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)液須補(bǔ)加3～8種血清替代因子。第19頁(yè)/共28頁(yè)細(xì)胞接種量細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌刺激細(xì)胞分裂的物質(zhì)，若細(xì)胞量太少，這些物質(zhì)分泌量少，而作用也小。接種細(xì)胞數(shù)量越大，細(xì)胞生長(zhǎng)為單層的速度越快，但細(xì)胞過(guò)多對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也不利。雞胚成纖維細(xì)胞為100萬(wàn)／m1小鼠或地鼠腎細(xì)胞為50萬(wàn)／m1猴腎細(xì)胞量為30萬(wàn)／ml傳代細(xì)胞為10～30萬(wàn)／m1第20頁(yè)/共28頁(yè)(1)細(xì)菌污染(2)真菌污染：念珠菌或酵母菌。培養(yǎng)液中可見(jiàn)黃白色小點(diǎn)狀懸浮物鏡檢時(shí)可見(jiàn)菌絲結(jié)構(gòu)。(3)支原體污染：污染率為50％～60％(4)病毒污染

①組織帶毒

②培養(yǎng)液帶毒4．細(xì)胞培養(yǎng)污染問(wèn)題第21頁(yè)/共28頁(yè)（1）血清：維持液內(nèi)犢牛血清含量一般不超過(guò)2％。（2）溫度：狂犬病病毒32℃，犬皰疹病毒36℃。（3）pH：（4）病毒接種劑量：應(yīng)以TCID50為依據(jù)一般按維持液的1％～10％(V／V)量接入。接種量小，細(xì)胞不能完全發(fā)生感染，會(huì)影響毒價(jià)；接種量過(guò)大，會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)感染性缺陷病毒。

(5)病毒接種方法：異步接毒和同步接毒。5.細(xì)胞培養(yǎng)病毒要素第22頁(yè)/共28頁(yè)6.病毒增殖指標(biāo)與收獲細(xì)胞病變(CPE)：①細(xì)胞圓縮，如痘病毒和呼腸孤病毒等；②細(xì)胞聚合，如腺病毒；③細(xì)胞融合形成合胞體，如副粘病毒和皰疹病毒；④輕微病變，如正粘病毒、冠狀病毒等。包涵體和血凝性：也可作為檢查病毒增殖的指標(biāo)。有些病毒不產(chǎn)生CPE。病毒收獲：CPE達(dá)80％時(shí)收獲，反復(fù)凍融多次使病毒釋放，然后離心除去細(xì)胞碎片，上清病毒液