病理學(xué)常用研究方法研究生課程

病理學(xué)常用研究方法研究生課程第1頁/共23頁整體水平：尸體解剖autopsy動物實驗animalexperiment細(xì)胞水平：光鏡組織切片light-microscope細(xì)胞培養(yǎng)cellculture流式細(xì)胞技術(shù)flowcytometry組織芯片tissuemicro-array組織微切割技術(shù)micro-dissection電鏡透射、掃描、免疫電鏡第2頁/共23頁蛋白水平：1.免疫組化immunohistochemstry2.WesternBlotting3.組織芯片tissuemicro-array基因水平：1.原位分子雜交(組織、染色體Fish)insituhybridization2.基因芯片genechip3.組織芯片tissuemicro-array4.PCR及測序等PCRandsequence第3頁/共23頁一、免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化問題探討本世紀(jì)70年代問世抗體種類急速增加，交叉反應(yīng)存在免疫組化技術(shù)方法不斷問世使用的試劑或?qū)嶒炇覘l件不同操作人員的熟練程度病理醫(yī)生的結(jié)果判定水平及關(guān)聯(lián)知識解決標(biāo)準(zhǔn)化的問題勢在必行第4頁/共23頁(一)方法的選擇目前常用的免疫組化方法有：PAP、ABC、APAAP法、S-P方法等各種方法只要運用得好，都會得到滿意的結(jié)果建議：在我們省內(nèi)都采用S-P法第5頁/共23頁S-P法的優(yōu)點①方法統(tǒng)一②有配套的即用型抗體、試劑盒和顯色試劑盒③一般2-3小時(30’-60’)，而ABC法需1天，分子量小(60KD)，穿透力強④靈敏性高，特異性強，4個亞基都能于二抗上的生物素結(jié)合，而且結(jié)合鍵強⑤背景低，非特異性反應(yīng)少，等電點為6.5，接近于中性，不與內(nèi)源性凝集素樣物質(zhì)結(jié)合,而ABC法為10第6頁/共23頁S-P法與ABC法的區(qū)別S-P法：Streptaridinperoxidaseconjugataedmethod

鏈霉菌素抗生物素蛋白——過氧化物酶連接法

ABC法：

Avidin-Biotinperoxidasecomplexmethod

卵白素親生物素——過氧化酶復(fù)合物法S-P法中的鏈霉菌素抗生物素蛋白取代了ABC方法中的卵白素和生物素即：卵白素中的4個亞基一方面與第二抗體上的生物素結(jié)合，另一方面還與復(fù)合物中的生物素結(jié)合第7頁/共23頁一抗二抗卵白素生物素過氧化物酶A------B-------C一抗二抗鏈菌素抗生物素蛋白過氧化物酶ABC法：S-P法：第8頁/共23頁(二)固定、包埋固定液：一般10%中性緩沖福爾馬林，PH7.3-7.4(PBS配制)固定時間：應(yīng)少于24小時，固定時間越長，抗原丟失越多固定液量或組織塊大?。航M織為1/3，固定液2/3大體標(biāo)本：切下一塊固定第9頁/共23頁包埋：起初免疫組化對蠟溫的要求很嚴(yán)，溫度一高會嚴(yán)重影響結(jié)果?，F(xiàn)在由于抗體質(zhì)量的提高，以及抗原恢復(fù)方法的問世，多數(shù)人又忽視了蠟溫的問題。個人認(rèn)為：盡管有抗原修復(fù)方法，但不如開始就不使抗原破壞，另外，蠟溫過高，組織變脆，不易切成大片，容易脫片。因此，要控制蠟溫在65℃以下第10頁/共23頁(三)抗原修復(fù)(抗原暴露、抗原復(fù)原)組織中存在某種抗原、但用特異性抗體，卻為陰性其原因是：①固定、包埋后部分抗原決定簇與核酸或其它蛋白抗原發(fā)生了交聯(lián)，形成網(wǎng)絡(luò)②固定液中的醛基本身也會發(fā)生交聯(lián)，而封閉抗原第11頁/共23頁抗原修復(fù)的目的：就是要打開交聯(lián)，暴露抗原決定簇，有利于抗原抗體反應(yīng)，抗原修復(fù)的方法從大的方面講有兩種：只限于需要抗原修復(fù)的抗體①熱微波高壓鍋水浴鍋②酶消化胰蛋白酶胃蛋白酶第12頁/共23頁熱修復(fù)：

0.01M檸檬酸緩沖液，PH=6.0，95℃，10分鐘注意：脫片多——多聚L賴氨酸干片選醫(yī)用微波爐酶消化：1.細(xì)胞內(nèi)抗原——0.1%胰蛋白酶20’37℃2.間質(zhì)抗原——4%胃蛋白酶37℃，4-8小時第13頁/共23頁(八)免疫組織化學(xué)的發(fā)展1.免疫PCR：主要用于臨床生物分子檢測方面血清(Ag)電泳+Ab+無關(guān)引物擴增→顯色意義：1.原來較弱、水平較低的酶等，用免疫PCR就可以檢測出來

2.需要較長或一定時間才能查出來

用免疫PCR法，就可提前查出來

如：病毒性心肌炎、血腫CPK檢測

心梗早期心肌酶譜的檢測等心梗預(yù)報：心絞痛→一般認(rèn)為沒有酶譜改變，設(shè)想用免疫PCR就可能發(fā)現(xiàn)改變第14頁/共23頁2.原位免疫PCR在組織切片上有定位

Ag+Ab1+Ab2→卵白素→洗凈→生物素標(biāo)記的DNA片斷→洗凈→原位PCR擴增→洗凈→ACB或S-P顯色特點：①提高陽性率②定位好第15頁/共23頁2.擴增：Total:25μl①PCRbuffer2.5μl②mixeddNTP2.0μl③dH2O16.375μl④primer11.0μlprimer21.0μl⑤Taq0.125μl⑥D(zhuǎn)NAtemplate2.0μl94℃25”→55℃25”→72℃40”30cycles第16頁/共23頁3.Agarose2-5%，用1×TBE電泳①擴增后液5μl+1μlloadingbuffer②溴化乙淀染色20’，UV照射下確認(rèn)泳帶→照相4.DNA收集

RECOCHIP法第17頁/共23頁三、WesternBlotting1.提取蛋白①500μl的hypotonicbuffer+組織2mm3勻漿器粉碎→冰上放置30’②15000轉(zhuǎn)/分，4℃，30’。

上清：細(xì)胞質(zhì)蛋白，+250μl3×loadingbuffer

沉淀物+750μl×loadingbuffer

再次粉碎、離心，上清為細(xì)胞膜蛋白③2-氫硫基乙醇7.5μl(1/100)混合④95℃沸騰5分鐘→冰上放置第18頁/共23頁2.蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度制備：BSA，0，0.5，1，2mg/ml

比色：測定系數(shù)換算成含量→計算出每個樣品加樣量3.電泳丙烯酰胺上部膠、下部膠marker樣品4.轉(zhuǎn)膜5.洗膜→一抗、二抗→顯色或自顯影第19頁/共23頁四、組織芯片(TissueMicro-Array,TMA)

組織芯片技術(shù)是一種特殊生物芯片技術(shù)，它是將幾十個或幾百個不同個體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計的順序排列在一張玻片進行分析研究，是一種高通量、多樣本的分析工具。它使科研人員第一次有可能同時對幾百甚至上千種正?；蚣膊∫约凹膊“l(fā)展不同階段的自然病理生理狀態(tài)下的組織樣本，進行某一個或多個特定的基因，或與其相關(guān)的表達產(chǎn)物的研究。第20頁/共23頁應(yīng)用免疫組化DNA或RNA原位雜交FISH原位PCR低密度芯片(50-70個標(biāo)本)、高密度芯片(500個標(biāo)本)