CD4+和CD8+T-淋巴細(xì)胞檢測操作細(xì)則

/CD４+和CＤ8+Ｔ淋巴細(xì)胞檢測操作細(xì)則１．目的根據(jù)《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》(20０9年修訂版），對(duì)CD4+和ＣD８＋T淋巴細(xì)胞檢測（流式細(xì)胞儀FACSCalibur）的操作進(jìn)行細(xì)化，以規(guī)范本中心CD4+和CD８+T淋巴細(xì)胞檢測工作，保證結(jié)果準(zhǔn)確.２。適用范圍本操作細(xì)則適用于本中心ＣＤ４＋和CD8+ＴＴ淋巴細(xì)胞檢測。3.職責(zé)3。１檢測人員負(fù)責(zé)按本操作細(xì)則進(jìn)行CD４+和CD8+TT淋巴細(xì)胞檢測。３．2復(fù)核人員負(fù)責(zé)對(duì)CD4＋和CD8+TT淋巴細(xì)胞檢測操作及結(jié)果進(jìn)行復(fù)核。3.3科室負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)對(duì)檢測工作進(jìn)行綜合管理。4.操作程序４.1方法：流式細(xì)胞儀單平臺(tái)法。４.２設(shè)備：生物安全柜、振蕩器、移液器、流式細(xì)胞儀ＦACＳCaliｂur。4。4試劑：經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)，批批檢合格，在有效期內(nèi)的商用CD４+和CD8+的檢測試劑.4．5檢測步驟4。5．1標(biāo)本制備:4。5。1。1將試劑盒取出置于室溫，平衡30分鐘。然后按需要取出相應(yīng)數(shù)目的絕對(duì)計(jì)數(shù)管TｒｕＣountTube，按順序依次編號(hào)。4．5。1．2用反向加樣法在Ｔu(píng)bｅ中加入50ｕｌ充分混勻的抗凝全血，注意血不要碰到試管底部的微球（Beads)。4.５.1.3取2０uｌ熒光抗體加入到管中，注意：不要碰到血。渦旋混勻，室溫避光放置15min。4.５。１．4取出加入450ul1×FＡCS溶血素,充分混勻,避光放置15mｉn.4．5。1．52４小時(shí)內(nèi)上機(jī)用MultiSET軟件獲取細(xì)胞進(jìn)行檢測，上機(jī)前應(yīng)充分混勻.4.5.2。FAＣSＣaliｂｕr上機(jī)操作：執(zhí)行FACSCalibur開機(jī)程序,進(jìn)入MｕltiTEST軟件。在出現(xiàn)的“Ｓiｇｎiｎ"窗口中輸入操作者姓名、單位、領(lǐng)導(dǎo)姓名等相關(guān)信息,計(jì)算機(jī)將保存這些信息，單擊“Accepｔ"。進(jìn)入“Seｔｕｐ"窗口:在“Ｄａt(yī)aSourcｅ”對(duì)話框中選擇“ＦｒoｍＣytomｅter：AcquiｓitiｏｎａndAnalysis”，在“ＥｎｔrｙLｅveｌＰrefｉx”中選擇“Ｓａmｐlenａｍe”；在“AutomaｔｉｃSavｉｎｇOpｔions"中選擇“DataFile”、“LaｂoratoryRｅpｏrｔ”、“PhysicianRepoｒt”,軟件會(huì)自動(dòng)生成一個(gè)文件,文件的默認(rèn)路徑Ｆaｃｓtation\BDｆｉle\Multiseｔ＼DDMMYY文件夾；在“VｉewＲeｐortｓ"中選擇“Ｕｎtiｌ‘Next’ButtoｎPreｓsｅｄ”.單擊“Ａｃcept"，進(jìn)入“FACSComp”窗口,單擊“SｋipＦＡCSＣoｍp"。進(jìn)入“TesｔPrｅfs”窗口,在“PhｙsｉciａnReportChｏices”中,這一項(xiàng)可以是全選，運(yùn)行了一種試劑，會(huì)自動(dòng)報(bào)告相應(yīng)的結(jié)果。在窗口的最下方點(diǎn)“LｏｔＩds",跳出一窗口，點(diǎn)此窗口左側(cè)的“ＡｂsｏlutｅＣountＢeａｄs"，在此窗口右側(cè)輸入TｒｕCoｕｎttube的批號(hào)和Bｅads總數(shù)（標(biāo)在包裝袋上),單擊“Save”。單擊“Accept”。進(jìn)入“Ｓamplｅｓ"窗口，在表格中輸入相應(yīng)的Ｐａt(yī)ｉeｎtＮaｍｅ、ＩD、CaseＮｕmｂeｒ，在Panｅl中選擇CＤ4/8/3Ｔrｕｃ．在窗口最上方的“Cytometｅr"的下拉菜單中，單擊“InstｒｕmｅnｔSｅtting”，在出現(xiàn)的新對(duì)話框中單擊“Oｐｅn”；打開此路徑下Facsｔatｉon\BＤｆｉｌｅ\IｎstruｍentSｅtting\Cａliｂｕr.LNW文件。調(diào)用儀器各個(gè)參數(shù)的條件，選好后單擊“Set”，“Ｄonｅ".單擊“RunTestｓ",上樣,調(diào)整SSC電壓和閾值后,單擊“Aｃquｉre”。獲取完成后，可以人工調(diào)整各個(gè)門的大小,單擊“Cｏnｔinuｅ”;打印“PhｙsＲeport”.繼續(xù)下一個(gè)實(shí)驗(yàn)，或單擊“Ｑｕｉt",“Doｎ’ｔＳave”,退出MｕltｉTest軟件.執(zhí)行FＡＣSCａｌｉbuｒ關(guān)機(jī)機(jī)程序后，依次關(guān)閉電腦、儀器、穩(wěn)壓器、變壓器.將儀器的壓力閥打到減壓位置。4.５.4注意事項(xiàng)樣本使用ＥDTA抗凝全血，室溫放置，24小時(shí)內(nèi)處理,處理前充分混勻。取血時(shí)要采用反向加樣法,即加樣槍吸取血樣時(shí),打到第二檔,放時(shí)打到第一檔，保證血量的準(zhǔn)確，減少誤差。染色和溶血步驟應(yīng)在室溫避光進(jìn)行,并充分混勻過程中，盡量防止血樣的飛濺,以免血樣留在管壁上.本實(shí)驗(yàn)為免洗試劑，操作簡單，減少細(xì)胞的丟失提高工作效率和計(jì)數(shù)精確度。TｒuCOUNT管2—２５°C保存,從冰箱取出后，應(yīng)恢復(fù)室溫再打開封條，保證ＴrｕＣOUNT管包裝袋密閉,袋內(nèi)干燥劑變成粉紅色時(shí)，ＴruCOUNT管應(yīng)棄去不用．遵守HIV實(shí)驗(yàn)管理規(guī)范和生物安全守則。嚴(yán)格防止交叉感染，操作時(shí)必須戴手套,穿著工作衣。所有樣品，洗滌液和各種廢物、棄物都按傳染物處理。4剩余樣品及廢棄物應(yīng)經(jīng)121℃高壓20分鐘或用次氯酸鈉等消毒劑處