血管狹窄后切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn),病理學(xué)論文

血管狹窄后切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn),病理學(xué)論文研究表示清楚，當(dāng)血管壁的完好性遭到毀壞時(shí)，狹窄局部的血管壁切應(yīng)力(wallshearstress，WSS)過(guò)高導(dǎo)致與血流接觸的內(nèi)膜損傷，能夠誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞異常表示出組織因子(tissuefactor，TF)［1，2，3，4］。本研究應(yīng)用套扎法建立大鼠頸總動(dòng)脈狹窄模型，應(yīng)用免疫組化和原位雜交法結(jié)合圖像分析，對(duì)血管狹窄后切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞TF早期表示出規(guī)律進(jìn)行了初步在體研究。1材料與方式方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SPF級(jí)SD雄性大鼠45只，質(zhì)量32018.5g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組(C組，n=5)、狹窄組(S組，n=40)，狹窄組分0.25、0.5、1、2、4、8、16、24h，8個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)各5只大鼠。1.2狹窄模型制作及標(biāo)本采集以2.5%戊巴比妥鈉40mg/kg體重腹腔注射麻醉，待靜臥后睫毛反射消失，仰位固定。無(wú)菌條件下，頸部備皮消毒后，頸部正中行長(zhǎng)約2.5cm縱行切口，逐層分離，游離出左側(cè)頸總動(dòng)脈中段長(zhǎng)8～10mm，套入縱形剖開(kāi)的內(nèi)徑約0.3mm，長(zhǎng)3mm的硅膠管，外用4號(hào)絲線雙重扎緊，復(fù)位后縫皮。分別在術(shù)后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h，8個(gè)時(shí)相點(diǎn)，使用TS420型多普勒血流儀，1.5prb探頭，檢測(cè)狹窄下游5mm內(nèi)的每分平均血流量Q，檢測(cè)時(shí)小心游離出頸總動(dòng)脈外膜的疏松結(jié)締組織，保持探頭與血流方向垂直，每例檢測(cè)約5～10min，待顯示平穩(wěn)時(shí)記錄數(shù)字，得到每分平均血流量Q。隨后在Digitex數(shù)字減影血管成像系統(tǒng)下，仰位固定，用自制導(dǎo)管(直徑約1.5mm)刺入左心室，快速注射1ml碘fo醇(240mg/ml)，即時(shí)進(jìn)行正位數(shù)字減影血管造影(Digitalsubtractionangiography，DSA)，測(cè)量正常和狹窄血管內(nèi)經(jīng)D，計(jì)算出狹窄程度。C組只分離左頸總動(dòng)脈，進(jìn)行Q和D值的測(cè)量。隨后采用復(fù)合固定液(4%多聚甲醛，1DEPC，0.1mol/LPBS，pH7.4)約30ml直接低壓灌注，0.1h后取下狹窄段血管固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度6m。1.3切應(yīng)力計(jì)算把測(cè)得在體血管內(nèi)徑(D)和每分平均血流量(Q)代入Poiseiulle流體公式計(jì)量動(dòng)脈平均壁切應(yīng)力:Tw=32Q/D3(血液黏稠度=0.035dynes.s/cm2.5］)。1.4TFmＲNA采用原位雜交法檢測(cè)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水并水化后，參照試劑盒講明，3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37.0℃消化0.5h，預(yù)雜交液恒溫箱40.0℃6h，TF寡核苷酸探針(MK3023，武漢博士德生物工程公司提供)，雜交液恒溫箱內(nèi)42.0℃雜交8h，封閉液37.0℃孵育0.5h，生物素化鼠抗地高辛37.0℃孵育1.0h，滴加SABC復(fù)合物37.0℃孵育0.5h，生物素化過(guò)氧化酶37.0℃孵育0.5h，DAB顯色(試劑盒AＲ1022，武漢博士德生物工程公司提供)。按試劑盒提供的已經(jīng)知道陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替雜交液作為陰性對(duì)照。TFmＲNA陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒。1.5TF蛋白采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)石蠟切片脫蠟至水并水化，參照試劑盒講明，3%過(guò)氧化氫室溫下孵育0.25h，浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)，微波爐中火加熱至沸騰，反復(fù)3次，每次間隔0.1h，10%羊血清37.0℃孵育0.25h，分別參加一抗兔抗TF多克隆抗體(BA1714，武漢博士德生物工程公司提供，稀釋度1∶120)，4.0℃冰箱放置8h，生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(二抗)20.0℃孵育0.5h，鏈霉菌抗生物蛋白-過(guò)氧化物酶溶液20.0℃孵育0.5h，DAB顯色(試劑盒AＲ1022，武漢博士德生物工程公司提供)。按試劑盒提供的已經(jīng)知道陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替雜交液作為陰性對(duì)照。TF陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞胞漿著色，呈棕黃色。1.6圖像分析以細(xì)胞漿出現(xiàn)的棕色細(xì)顆粒為陽(yáng)性染色，采用LeicaQwin病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性表示出物的平均灰度值(meangray，MG)，灰度值0(黑色，表示出最強(qiáng))，255(白色，無(wú)表示出)。每張切片測(cè)量前均用該片空白區(qū)校正并調(diào)節(jié)光亮度，以到達(dá)不同指標(biāo)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)一樣。本實(shí)驗(yàn)各組切片空白區(qū)灰度值平均為245，每組抽取5張切片，在630光鏡下隨機(jī)選取4個(gè)區(qū)域，測(cè)定內(nèi)膜的MG，以相對(duì)平均灰度值(ＲMG)表示，即陰性對(duì)照MG減去實(shí)驗(yàn)MG。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xs)表示，SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間均數(shù)比擬用單因素方差分析，以P＜0.05確定有顯著性。2結(jié)果2.1血流量和切應(yīng)力變化DSA測(cè)得靜息狀態(tài)下大鼠左頸動(dòng)脈正常血管內(nèi)徑為1.140.05mm，各組狹窄血管內(nèi)徑為0.210.02mm，本模型的平均狹窄率為82%。靜息狀態(tài)下大鼠左頸動(dòng)脈狹窄前和狹窄后各時(shí)相血流量見(jiàn)表1。對(duì)照組和狹窄組的血流量和切應(yīng)力有顯著性差異(P＜0.01)，狹窄后各組間血流量和切應(yīng)力無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。2.2TFmＲNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表示出變化正常對(duì)照組頸總動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞的TFmＲNA和蛋白有微量表示出，狹窄0.25h后，檢測(cè)到頸動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞表示出的TFmＲNA和蛋白加強(qiáng)(P＜0.01)，主要存在于胞漿，隨著狹窄時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及著色程度逐步增加，狹窄后4h到達(dá)峰值(P＜0.01，表2)，以后逐步下降，但各時(shí)相點(diǎn)與正常組相比均顯著升高(P＜0.01)，狹窄后24h，相對(duì)平均灰度值仍然高于對(duì)照組(P＜0.01，表2)。3討論血液動(dòng)力學(xué)作用在新生血管構(gòu)成、血管壁構(gòu)造重建以及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著肯定性的作用［6］。血流作用于動(dòng)脈的力能夠分解成兩個(gè)主要的向量［7，8］:一是垂直于管壁的代表壓力的向量，二是作用于內(nèi)皮細(xì)胞外表與管壁平行因血液的沾滯性而產(chǎn)生的摩擦力，即WSS。血管壁的所有成份(內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等)都承受脈動(dòng)壓力產(chǎn)生的伸張，但內(nèi)皮細(xì)胞外表所承受的力以WSS為主［［9，10］。硅膠管套扎大鼠頸總動(dòng)脈中段造成的狹窄不損傷血管內(nèi)膜［11］，大鼠左頸內(nèi)動(dòng)脈的近心段長(zhǎng)直均勻且無(wú)分支，能夠應(yīng)用Poiseiulle流體公式計(jì)量平均WSS［5］。運(yùn)用數(shù)字減影血管造影和多普勒血流儀能精到準(zhǔn)確地測(cè)量在體血管內(nèi)徑和每分平均血流量，計(jì)算出準(zhǔn)確的狹窄程度和切應(yīng)力。本模型造成的狹窄到達(dá)重度，局部切應(yīng)力比狹窄前加強(qiáng)了3.8倍，15min后TF的mＲNA轉(zhuǎn)錄和蛋白開(kāi)場(chǎng)表示出，證實(shí)了局部的切應(yīng)力過(guò)高導(dǎo)致血管內(nèi)膜損傷，是誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞異常表示出組織因子，導(dǎo)致血栓構(gòu)成和斑塊產(chǎn)生［5，12，13］。體外研究表示清楚，內(nèi)皮細(xì)胞TFmＲNA和蛋白在基礎(chǔ)狀態(tài)下幾乎檢測(cè)不到，給予切應(yīng)力誘導(dǎo)后表示出上調(diào)，講明TF基因上調(diào)的誘發(fā)與內(nèi)皮細(xì)胞的切應(yīng)力變化有關(guān)［14，15］。本實(shí)驗(yàn)在大鼠頸總動(dòng)脈狹窄段的高切應(yīng)力區(qū)觀察到內(nèi)膜的TF的mＲNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表示出均明顯加強(qiáng)，約4h到達(dá)峰值，講明只要血管局部狹窄，造成血流紊亂，切應(yīng)力發(fā)生了改變，就能夠早期誘導(dǎo)TF基因表示出。體外實(shí)驗(yàn)研究表示清楚，這可能主要與即早基因家族(immediateearlygenes，IEGs)的Egr-1和Sp1有關(guān)［15］，轉(zhuǎn)錄因子核因子ppa-B(NF-B)和活化蛋白-1(AP-1)活化后可以以介入其上調(diào)［16］。多種因素使內(nèi)皮細(xì)胞TF基因表示出上調(diào)，血管損傷后，在多種炎性因子如白介素-1(IL-1)、脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-(TNF-)、干擾素(INF)、內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(ICAM-1)、前列環(huán)素(PGI2)等作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞TF基因表示出可以以加強(qiáng)［17-20］。以下為參考文獻(xiàn)［1］KAWAHAＲAD，MATSUDAT.Hydrodynamicshear-stress-dependentretentionofendothelialandendothelialprogenitorcellsadheredtovascularendothelialgrowthfactor-fixedsur-faces［J］.BiomedMaterＲesBApplBiomater.2020，100(5):1218-1228.［2］DELAPAZNG，WALSHETE，LEACHLL，etal.Ｒoleofshear-stress-inducedVEGFexpressioninendothelialcellsurvival［J］.CellSci，2020，15;125(4):831-843.［3］MAZZOLAIL，SILACCIP，BOUZOUＲENEK，etal.Tissuefactoractivityisupregulatedinhumanendothelialcellsex-posedtooscillatoryshearstress［J］.ThrombHaemost，2002，87(6):1062-1068.［4］G