PCR檢測技術(shù)的分析前質(zhì)量控制

臨床基因擴增檢測技術(shù)

分析前質(zhì)量控制上海市臨床檢驗中心徐翀現(xiàn)在是1頁\一共有47頁\編輯于星期一全面質(zhì)量管理阿曼德·費根堡姆（ArmandVallinFeigenbaum）——全面質(zhì)量控制之父、質(zhì)量大師、《全面質(zhì)量控制》的作者最早提出全面質(zhì)量管理概念，努力擯棄當時最受關(guān)注的質(zhì)量控制的技術(shù)方法，而將質(zhì)量控制作為一種管理方法?，F(xiàn)在是2頁\一共有47頁\編輯于星期一臨床實驗室的全面質(zhì)量管理2003年3月正式頒布《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力專用要求》（ISO/IEC15189），其核心就是加強實驗室的全面質(zhì)量管理。全面質(zhì)量管理就是按系統(tǒng)學的原理，建立一個體系，使在實驗的全過程中所有影響實驗結(jié)果的要求和環(huán)節(jié)都處于受控狀態(tài)，保證每個環(huán)節(jié)的協(xié)調(diào)和統(tǒng)一，確保實驗結(jié)果始終可靠?，F(xiàn)在是3頁\一共有47頁\編輯于星期一全面質(zhì)量管理的劃分為了方便管理，ISO/IEC15189文件將實驗過程各環(huán)節(jié)劃分為分析前質(zhì)量管理、分析中質(zhì)量管理和分析后質(zhì)量管理?，F(xiàn)在是4頁\一共有47頁\編輯于星期一分析前質(zhì)量管理的內(nèi)涵ISO/IEC15189對于分析前程序的明確定義：按照時間順序，從臨床醫(yī)生開出醫(yī)囑開始，到分析檢驗程序時終止的步驟，包括檢驗申請、患者的準備、原始樣品的采集、運送到實驗室并在實驗室進行傳輸。這個過程大部分工作都是醫(yī)生、護士、護工等在實驗室以外完成的?，F(xiàn)在是5頁\一共有47頁\編輯于星期一分析后質(zhì)量評估分析中質(zhì)量控制

患者準備檢查患者申請檢驗標本采集標本運送標本處理人員素質(zhì)工作環(huán)境實驗用水實驗室管理儀器質(zhì)量保證方法選擇與評價試劑選擇與評價建立操作規(guī)程室內(nèi)質(zhì)控及分析標本分析測定臨床醫(yī)師反饋信息室內(nèi)復查保留標本隨時復查運送報告患者投訴室間質(zhì)評登記填發(fā)報告分析前質(zhì)量保證分析中質(zhì)量控制現(xiàn)在是6頁\一共有47頁\編輯于星期一分析前程序的特點分析前階段所占時間比例大?，F(xiàn)在是7頁\一共有47頁\編輯于星期一分析前程序的特點分析前質(zhì)量管理是最易出現(xiàn)問題、涉及人員最多、潛在因素最多、最難控制的環(huán)節(jié)?，F(xiàn)在是8頁\一共有47頁\編輯于星期一發(fā)生在臨床實驗室的錯誤分析MarioPlebani.Errorsinclinicallaboratoriesorerrorsinlaboratorymedicine?ClinicalChemicalLaboratoryMedicine.2006,Volume44,Issue6,750–759現(xiàn)在是9頁\一共有47頁\編輯于星期一發(fā)生在臨床實驗室的錯誤分析臨床反饋不滿意的檢驗結(jié)果，80%的報告最終可溯源到標本質(zhì)量不符合要求?，F(xiàn)在是10頁\一共有47頁\編輯于星期一《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2006]73號

第十五條醫(yī)療機構(gòu)和采供血機構(gòu)應有分析前質(zhì)量保證措施，應制定患者準備、標本采集、標本貯存、標本運送、標本接收等標準操作規(guī)程，標本采集和接收記錄完整，并由醫(yī)療機構(gòu)和采供血機構(gòu)組織實施?，F(xiàn)在是11頁\一共有47頁\編輯于星期一上海市臨床基因擴增檢驗及相關(guān)分子診斷技術(shù)審核表現(xiàn)在是12頁\一共有47頁\編輯于星期一做好分析前質(zhì)量管理要點建立實驗室分析前質(zhì)量管理文件加強與醫(yī)生、護士、受檢者和實驗室人員的溝通與培訓通過Lis-His網(wǎng)絡化管理現(xiàn)在是13頁\一共有47頁\編輯于星期一臨床基因擴增實驗室分析前質(zhì)量管理軟件：檢測人員：應當經(jīng)省級以上衛(wèi)生行政部門指定機構(gòu)技術(shù)培訓合格后，方可從事臨床基因擴增檢驗工作。臨床醫(yī)生、護士、護工及標本接收人員等需溝通與培訓?，F(xiàn)在是14頁\一共有47頁\編輯于星期一臨床基因擴增實驗室分析前質(zhì)量管理硬件

臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設置

1.試劑儲存和準備區(qū)

2.標本制備區(qū)

3.擴增反應混合物配制和擴增區(qū)

4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)

現(xiàn)在是15頁\一共有47頁\編輯于星期一臨床基因擴增實驗室分析前質(zhì)量管理質(zhì)量手冊

程序性文件

質(zhì)量記錄（表格、記錄本等）

作業(yè)指導書（標準操作規(guī)程）

文件第三層次：具體工作人員使用更詳細文件

第四層次：用于質(zhì)量體系運行的證實依質(zhì)量體系文件層次圖綱領文件支持文件

證實監(jiān)督文

現(xiàn)在是16頁\一共有47頁\編輯于星期一分析前質(zhì)量管理相關(guān)SOP文件——臨床標本的采集、運送、接收和保存

每類標本或每個項目的特定標本如：血清、血漿、分泌物、尿液、痰、腦脊液、胸腹水及組織等，都應有一個采集、運送、接收和保存的SOP?，F(xiàn)在是17頁\一共有47頁\編輯于星期一分析前質(zhì)量管理相關(guān)SOP文件編寫目的：

通過規(guī)范相應臨床標本的采集方法、所用容器、運送方式、保存條件及接收，確保所采集的標本在檢測前的有效性?，F(xiàn)在是18頁\一共有47頁\編輯于星期一分析前質(zhì)量管理相關(guān)SOP文件基本內(nèi)容：特定標本采集的具體方法和步驟明確規(guī)定標本的采集容器要求明確標本的采集量明確標本采集后送到實驗室檢測所能允許的最大時間間隔明確標本采集后，在送往實驗室檢測前的保存方式和條件明確標本從采集處運送至實驗室過程中所要求的運送條件明確標本接收時，簽收的程序、拒收的標準和標本惟一編號的規(guī)則規(guī)定標本在實驗室內(nèi)的短期和長期保存條件和要求制定保證標本安全，即如何防止標本丟失、調(diào)換、變質(zhì)的措施現(xiàn)在是19頁\一共有47頁\編輯于星期一分析前質(zhì)量管理的核心問題醫(yī)囑（責任人——醫(yī)生）標本采集（責任人——醫(yī)生、護士）標本運送與保存（責任人——護工）標本驗收與保存（責任人——檢驗人員）現(xiàn)在是20頁\一共有47頁\編輯于星期一檢驗申請表信息充分患者的唯一標識醫(yī)生的姓名或唯一標識，最終檢驗報告目的地原始樣品的類型申請的檢驗項目患者的相關(guān)臨床資料，至少包括性別和出生日期原始樣品采集日期和時間實驗室收到樣品的日期和時間現(xiàn)在是21頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的采集標本采集時間對擴增結(jié)果的影響

病原體感染機體后，特定的臨床標本中，病原體含量能達到PCR檢出水平的時間點，并不能覆蓋整個感染過程，可能只是在感染或疾病發(fā)生發(fā)展過程中的某一個時間段。

如HBV何HCV感染后，在特異抗原和抗體出現(xiàn)以前，血循環(huán)中即可有較高濃度病原體存在，而當抗體出現(xiàn)后，病原體的濃度可能會低于PCR或RT-PCR方法的測定下限。現(xiàn)在是22頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的采集標本采集時間對擴增結(jié)果的影響采集血液標本需空腹，脂血干擾核酸測定采集肺結(jié)核患者標本，晨起后生理鹽水反復漱口后用力深咳現(xiàn)在是23頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的采集標本的采集類型血液標本：用于HBV、HCV檢測。研究表明對于病原體RNA測定，最好使用EDTA抗凝全血標本（嚴禁使用肝素），抗凝后6h內(nèi)分離血漿。如使用血清標本，則需盡快（2h內(nèi)）分離血清。痰液：結(jié)合分枝桿菌病檢測。各種分泌物：泌尿生殖道拭子用于衣原體檢測。尿液、腦脊液、漿膜腔液、胸腹水和組織等。PCR標本應獨立收集，密閉運輸，不能使用從其他檢測如生化、免疫、血液學檢測分出的標本?，F(xiàn)在是24頁\一共有47頁\編輯于星期一肝素對PCR檢測的影響肝素使DNA抽提得率降低肝素能結(jié)合并激活全血中多種蛋白酶原和補體系統(tǒng)，由此引起的一系列反應使DNA在提取過程中不斷降解。肝素在DNA提取過程中難以去除肝素為含多量硫酸基團的粘多糖硫酸酯，溶于水，不溶于有機溶劑。理化性質(zhì)決定了在DNA抽提過程中，不能被酚、氯仿去除，也不能被乙醇沉淀、洗滌去除?，F(xiàn)在是25頁\一共有47頁\編輯于星期一肝素對PCR檢測的影響肝素使PCR擴增效率降低肝素對DNA聚合酶具有強大的親和力，使后者不能與Mg2+作用形成正確的親引物-模板符合體的活性中心。肝素帶有強大負電荷，與DNA聚合酶結(jié)合后與同樣帶有較高負電荷的模板DNA之間產(chǎn)生排斥作用。肝素攜帶的強大負電荷中和反應體系中的陽離子如Mg2+和K+，使作為DNA聚合酶輔助因子的Mg2+濃度下降?，F(xiàn)在是26頁\一共有47頁\編輯于星期一使用一次性無菌及無核酸酶的材料綠頭管為含肝素類抗凝劑現(xiàn)在是27頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的采集標本采集過程泌尿生殖道分泌物采集消毒：采集部位如為泌尿生殖道，過度消毒可能會去掉或破壞靶微生物。采集：將拭子深入至尿道口2至3厘米處用力旋轉(zhuǎn)1至2圈。痰液采集患者漱口，用力咳出氣管深出第一口痰于清潔干燥無菌的容器內(nèi)。對于無痰或少痰的患者，可用45加溫的100g/LNaCl水溶液霧化吸入或改變體位以使痰液易于咳出。對于小兒可以輕壓胸骨柄上方以誘導咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集標本現(xiàn)在是28頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的運送與保存標本采集后，應盡快送至檢測實驗室。采集后的所有樣本在送至實驗室之前，均應暫放在2~8℃臨時保存。靶核酸為DNA的標本，如為無菌條件下采集，可在室溫下8小時內(nèi)運送。靶核酸為RNA的標本，短時間內(nèi)的運送（如10min左右），可在室溫下運送；如時間較長，則應在加冰條件下運送。如在標本中加入了適當?shù)姆€(wěn)定劑（如GITC）的血標本，則可在室溫下運送或郵寄。靶核酸為RNA的標本，采集后建議在4h內(nèi)送至實驗室。標本運送過程中應充分考慮生物安全問題。有合適的容器轉(zhuǎn)運標本，帶蓋的透明轉(zhuǎn)運盒，有生物危害標識?，F(xiàn)在是29頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的驗收標本接收的地點不宜放在在標本制備區(qū)，減少實驗室污染的機會?？稍谒膮^(qū)外單獨設置或與其他臨床標本接收處放在一起。現(xiàn)在是30頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的驗收采樣質(zhì)量評價血清（漿）標本：體積不少于2ml。觀察是否溶血、脂血、黃疸及其程度。嚴重溶血：血紅蛋白及其代謝產(chǎn)物可能抑制Taq酶活性，使PCR擴增效率明顯降低。嚴重黃疸：膽紅素可抑制Taq酶活性。脂血：低密度脂蛋白對熒光有屏蔽和吸收作用，故對RealTimePCR有干擾?，F(xiàn)在是31頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的驗收采樣質(zhì)量評價2.分泌物標本：從細胞組成、所需類型細胞的數(shù)量進行評價

泌尿生殖道分泌物標本可以顯微鏡下觀察是否有上皮細胞存在3.痰液標本：體積不少于5ml。外觀規(guī)定膿樣、血性、干酪樣及膿性粘液樣痰為合格。鏡下用油鏡觀察白細胞大于10個?，F(xiàn)在是32頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的驗收核對標本的采集時間，嚴格控制標本運送時間靶核酸為DNA的標本，如為無菌條件下采集，可在室溫下8小時內(nèi)送達。靶核酸為RNA的標本，采集后4h內(nèi)送至實驗室，并注意運送條件。現(xiàn)在是33頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的驗收標本的唯一性編號編號時，建議體現(xiàn)出項目的區(qū)別，比如：2012年3月19日，第一個送達的HBV-DNA標本，可編號成B12031901可用字母C用于HCV-RNA，T用于TB-DNA，P用于HPV-DNA的編號交接填表、簽名，拒收填表、簽名現(xiàn)在是34頁\一共有47頁\編輯于星期一臨床PCR實驗室標本接收記錄以上標本編號從

至

，送檢人（簽字）：

接收人（簽字）：

。以上標本編號從

至

，送檢人（簽字）：

接收人（簽字）：

。以上標本編號從

至

，送檢人（簽字）：

接收人（簽字）：

。

現(xiàn)在是35頁\一共有47頁\編輯于星期一臨床PCR實驗室標本拒收記錄（一）現(xiàn)在是36頁\一共有47頁\編輯于星期一臨床PCR實驗室標本拒收記錄（二）現(xiàn)在是37頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的處理和保存血清（漿）最理想的做法：分離血清（漿）時，分出兩管，一管用于測定，一管用于長期保存?zhèn)洳?。HBV：分離出的血清（漿）如不立即提取核酸，保存于-20℃待檢。

HCV：盡快分離血清(漿),如不立即提取RNA，保存于-20℃待檢。

RNA長期保存：吸取200μl血清，加20uRNasin（RNA酶抑制劑），保存于-70℃。如不分管，已發(fā)出結(jié)果報告的標本應及時轉(zhuǎn)移至冰箱保存，并由專人負責管理，保存1-2周（時間長短根據(jù)報告單上的承諾而定）?，F(xiàn)在是38頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的處理和保存全血標本全血標本如用于DNA提取，可4℃下短期保存（數(shù)天），時間長易降解，如用于RNA檢測，應在取血后盡快提取RNA。

最好將DNA或RNA提取后，置-70℃保存?，F(xiàn)在是39頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的處理和保存外周血單個核細胞用淋巴細胞分離液分離單個核細胞。

加紅細胞裂解液裂解殘余紅細胞，生理鹽水洗滌數(shù)次離心取沉淀。如短期內(nèi)不提取核酸，置-70℃保存?，F(xiàn)在是40頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的處理和保存淋巴細胞分離液分離單個核細胞現(xiàn)在是41頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的處理和保存外周血單個核細胞有研究表明，HCV-RNA和HGV-RNA的豐度外周血單個核細胞高于血漿。病毒感染外周血單個核細胞后并在其中復制，然后釋放入血漿，因此檢測細胞內(nèi)病毒RNA比檢測血漿更有價值?，F(xiàn)在是42頁\一共有47頁\編輯于星期一標本的處理和保存痰液由于痰標本中含