細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥專家講座

第三章細(xì)胞工程制藥

—轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第1頁2第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物

轉(zhuǎn)基因動物是指經(jīng)過試驗(yàn)方法，人工地把人們想要研究動物或人類基因，或者是有經(jīng)濟(jì)價(jià)值藥品蛋白質(zhì)基因等，通常稱為外源基因，導(dǎo)入動物受精卵（或早期胚胎細(xì)胞），使之與動物本身基因組整合在一起，這么外源基因能隨細(xì)胞分裂而增殖，并能穩(wěn)定地遺傳給下一代一類動物。細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第2頁外源目標(biāo)基因制備外源目標(biāo)基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇取得攜有目標(biāo)基因細(xì)胞選擇適當(dāng)體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及判定篩選所得轉(zhuǎn)基因動物品系細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第3頁以綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠為例：Geneconstruct

pEGFP-N1載體是一個(gè)把異源性蛋白質(zhì)融合至EGFPN端哺乳動物表示載體，含有人類巨細(xì)胞病毒（CMV）開啟子，SV40PolyA尾，pUC復(fù)制起始點(diǎn)（原核）和SV40復(fù)制起始點(diǎn)（真核），20個(gè)多克隆位點(diǎn)，含有篩選標(biāo)志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）抗性基因。異源性蛋白與EGFP閱讀框一致地克隆入pEGFP-N1，形成表示重組體在CMV開啟子開啟下，表示EGFP和目標(biāo)蛋白融合蛋白。波長490nm紫外線激發(fā)后，可在熒光顯微鏡下,觀察到綠色熒光，在各種異源生物中表示且無細(xì)胞毒性。細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第4頁microinjection

受精卵準(zhǔn)備胚胎操作過程顯微注射假孕母鼠準(zhǔn)備(養(yǎng)母)

胚胎移植細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第5頁TransgeneanalysisBiopsyPCRanalysisSouthernblot細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第6頁P(yáng)henotypicanalysisPhenotypicAnalysisonfoundersharboringGFPgene(9.5dpc)GFP+,GFP-embryosGFP+tailGFP-,GFP+mice細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第7頁Gurdonetal,Nature,1971,(蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA)---顯微注射技術(shù)嘗試Jaenisch，PNAS,1974,1976，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠囊胚，使病毒DNA整合到小鼠基因組中，并傳遞給后代---不能廣泛應(yīng)用，只是少數(shù)ES細(xì)胞整合外源基因，部分組織有外源基因

Gordonetal,PNAS,1980;Brinsteretal,Cell,1981;Costantini&Lacy,Nature,1981;Wagneretal,PNAS,1981---顯微注射技術(shù)建立，基因結(jié)構(gòu)沒有合理和認(rèn)真設(shè)計(jì)，不能分析基因生理功效第一階段：方法建立細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第8頁P(yáng)almiter,Brinster,Hammeretal,1982,Nature(MT-GH)---超級小鼠其它功效基因---基礎(chǔ)研究中一直使用Hammeretal,1985,Nature(rabbit,sheep,pig)GH為主，開始關(guān)注轉(zhuǎn)基因動物病理改變第二階段：轉(zhuǎn)基因小鼠模型及快速生長家畜細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第9頁TMtransgenemiceDenningetal,NatBiotech.(GT&PrP)Daietal,,NatBiotech(GT-outpig)Laietal,,Science(GT-outpig)GT:半乳糖轉(zhuǎn)移酶第三階段：異種器官移植(pig)和乳腺反應(yīng)器細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第10頁外源基因?qū)雱游锛?xì)胞方法：

轉(zhuǎn)基因動物制備：關(guān)鍵技是怎樣把目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入動物早期胚胎細(xì)胞中原核期胚胎顯微注射法反轉(zhuǎn)錄病毒感染法胚胎干細(xì)胞法精子載體法人工酵母染色體法受精前卵細(xì)胞顯微注射法細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第11頁

原核期胚胎顯微注射：

創(chuàng)始人Jaenish（1974),主要步驟：公母畜交配（或經(jīng)過人工授精）取得原核期受精卵，外源裸露DNA經(jīng)過徽注射導(dǎo)入受精卵，然后將徽注射后受精卵移入受體輸卵管中繼續(xù)發(fā)育。細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第12頁經(jīng)過激素療法使小鼠超數(shù)排卵，開始時(shí)注射雌性妊娠血清，48小時(shí)后再注射人絨毛膜促進(jìn)腺激素，這時(shí)小鼠便會超數(shù)排卵，普通情況下5-10個(gè)，超數(shù)排卵為35個(gè)；與雄性小鼠交配，然后殺掉小鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵將經(jīng)純化轉(zhuǎn)基因樣品快速注射入受精卵中變大雄性原核內(nèi)將25-40個(gè)注射了轉(zhuǎn)基因受精卵移植入代孕小鼠體內(nèi)；受精卵發(fā)育成胚胎，并繁殖成轉(zhuǎn)基因小鼠子代；從小鼠子代體內(nèi)取出DNA樣品，進(jìn)行雜交，判定轉(zhuǎn)基因整合是否及位點(diǎn)；子代小鼠間進(jìn)行再交配，繁殖，觀察轉(zhuǎn)基因是否遺傳及表示2023/4/20細(xì)胞工程13細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第13頁2023/4/20細(xì)胞工程141.可靠性高、重復(fù)性好2.對于小鼠來說，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物效率比較高3.導(dǎo)入DNA片段大小和類型不受限制4.轉(zhuǎn)基因在代與代之間傳遞穩(wěn)定性好5.整合位點(diǎn)隨意性可能對轉(zhuǎn)基因表示造成影響6.可能會出現(xiàn)不希望插入突變7.開發(fā)裝置和技術(shù)花費(fèi)大時(shí)間長細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第14頁2023/4/20細(xì)胞工程15顯微注射法取得轉(zhuǎn)基因鼠成活率細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第15頁2023/4/20細(xì)胞工程16利用脈沖電場提升細(xì)胞膜通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。此法簡單、效率較高，廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移。電穿孔法實(shí)現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)移細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第16頁

反轉(zhuǎn)錄病毒感染法：

利用反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs（長末端重復(fù)序列）區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄開啟子活性特點(diǎn)，將外源基因連接到LTR下部進(jìn)行重組，再包裝成為高滴度病毒顆粒，去直接感染受精卵或徽注入囊胚腔中，攜帶外源基因反轉(zhuǎn)錄病毒DNA能夠整合到宿主染色體上。轉(zhuǎn)錄開啟子細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第17頁2023/4/20細(xì)胞工程18

缺點(diǎn)：低拷貝數(shù)需要逆轉(zhuǎn)錄病毒插入DNA大小有限可能產(chǎn)生不希望重組高頻鑲嵌現(xiàn)象逆轉(zhuǎn)錄病毒序列可能干擾轉(zhuǎn)基因表示細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第18頁

胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法：將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移入ES，重新導(dǎo)入囊胚或經(jīng)篩選后對轉(zhuǎn)入外源基因ES進(jìn)行克隆，可培育轉(zhuǎn)基因個(gè)體。在小鼠上應(yīng)用成熟，大動物較晚。從豬胚胎中取得了干細(xì)胞克隆系1988，牛胚胎干細(xì)胞1990。建立大家畜ES細(xì)胞系仍很困難，但伴隨一些相關(guān)關(guān)鍵技術(shù)成熟，ES細(xì)胞介導(dǎo)法將會在轉(zhuǎn)基因動物研究中起到愈加主要作用細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第19頁精子載體法

直接用精子作為外源DNA載體基因轉(zhuǎn)移方法。精子直接與外源DNA混合培養(yǎng)，外源基因能夠進(jìn)入精子頭部，受精后能發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物，其整合率低（雞為6.0%），但表示率高達(dá)50%。許多原因影響DNA與精子結(jié)合。較長DNA片段比較短DNA片段（150～750dp）更輕易被精子所攝取。對精子和附睪精子清洗可提升精子與DNA結(jié)合率。當(dāng)前已采取陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法，脂質(zhì)體借靜電作用吸附于細(xì)胞表面，經(jīng)過與細(xì)胞膜融合，細(xì)胞內(nèi)吞而將結(jié)合基因?qū)爰?xì)胞。細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第20頁受精前卵細(xì)胞顯微注射法

Anthony等（1999）嘗試一個(gè)新方法：預(yù)先將小鼠精子進(jìn)行破膜處理，與編碼綠色熒光蛋白GFP匯報(bào)分子外源DNA短時(shí)間（1min）共孵育，然后徽注射入減數(shù)分裂II期卵母細(xì)胞質(zhì)中，取得64%～94%轉(zhuǎn)基因表示胚胎。將轉(zhuǎn)GFP胚胎移植，20%后代表現(xiàn)為基因整合。此項(xiàng)研究揭示，精子膜經(jīng)冷凍干燥或解凍處理后，外源DNA可穿過外膜，吸附于內(nèi)膜。因另外源DNA能經(jīng)過精子徽注射有效轉(zhuǎn)入卵母細(xì)胞，經(jīng)膜處理攜外源DNA精子徽注射是一個(gè)有效轉(zhuǎn)基因伎倆。細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第21頁2023/4/20細(xì)胞工程22四種方法比較方法顯微注射胚胎干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒精子介導(dǎo)優(yōu)點(diǎn)外源基因整合效率較高，不需要載體，目標(biāo)基因長度可達(dá)100Kb外源DNA整合率高；整合在生殖細(xì)胞中百分比也很高?？稍谡宵c(diǎn)整合轉(zhuǎn)移基因單個(gè)拷貝；該方法簡單、方便缺點(diǎn)精密儀器，技術(shù)操作較難，易造成宿主動物基因組插入突變ES細(xì)胞株不易建立，長久培養(yǎng)后出現(xiàn)分化現(xiàn)象；生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物都是嵌合體插入基因有大小程度；嵌合性很高；外源DNA在動物各種組織中分布不均有些結(jié)果不能重復(fù)細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第22頁

酵母人工染色體(YAC)載體是近年發(fā)展起來新型載體,它能克隆百萬對堿基大片段DNA。作為制作轉(zhuǎn)基因動物載體含有以下優(yōu)點(diǎn)：A.

確保大片段DNA完整性B.

提升較長外源片段在動物轉(zhuǎn)基因時(shí)整合率C.

確保目標(biāo)基因上下游側(cè)翼序列完整性，因而能夠消除或減弱基因整合后位置效應(yīng).所以，YAC介導(dǎo)法制備轉(zhuǎn)基因動物含有遼闊應(yīng)用前景

酵母人工染色體(YAC)法細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第23頁

普通把目標(biāo)片段在器官或組織中表示轉(zhuǎn)基因動物叫動物生物反應(yīng)器（bioreactor），幾乎任何有生命器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)角度考慮，生物反應(yīng)器選擇組織和器官要方便產(chǎn)物取得，比如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動物乳腺生物反應(yīng)器,動物血液生物反應(yīng)器和動物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器研究最為引人注目。第二節(jié)動物生物反應(yīng)器細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第24頁※醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用

a.抗出血藥品

b.抗凝血藥品

c.血栓治療藥品

d.肺氣腫治療藥品

e.免疫治療藥品

f.人型化單克隆抗體荷蘭：GenPharm企業(yè)用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)EPO，產(chǎn)值40億美元英國：生產(chǎn)1-抗胰蛋白酶制劑（治療肺氣腫病）轉(zhuǎn)基因羊,一升羊奶6000美元1999年，只有三種產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗(yàn)；到年，已經(jīng)有70各種進(jìn)入臨床試驗(yàn)或即將進(jìn)入市場。細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第25頁

應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物/乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白是藥品生產(chǎn)一個(gè)全新模式，含有投資成本低、藥品開發(fā)周期短和經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)，將成為21世紀(jì)最含有巨額經(jīng)濟(jì)利潤新型醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。

細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第26頁動物乳腺生物反應(yīng)器

經(jīng)過家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價(jià)人體藥用蛋白，是研究熱點(diǎn)。從1987年Gordon等在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中得到人組織型纖維蛋白溶酶原激活因子（tPA），到現(xiàn)在已經(jīng)有數(shù)十種人體蛋白在家畜乳腺中表示。我國已構(gòu)建了30各種乳腺特異表示載體，在表示載體構(gòu)建合理性和有效性方面取得了成效。在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中，人血清白蛋白表示量到達(dá)3.5g/L，人凝血因子IX表示量已到達(dá)50mg/L以上，人EPO表示量到達(dá)100mg/L以上，BLG表示量到達(dá)25g/L，均屬于國際領(lǐng)先水平。細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第27頁2023/4/20細(xì)胞工程28應(yīng)用重組DNA技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù),先將外源基因置于乳腺特異性調(diào)控序列之下,再將該基因轉(zhuǎn)移到尚處于原核階段或1～2細(xì)胞受精卵動物胚胎中,經(jīng)胚胎移植得到轉(zhuǎn)基因乳腺表示動物個(gè)體,經(jīng)過回收乳汁取得表示產(chǎn)物。

動物乳腺生物反應(yīng)器細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第28頁

表示載體構(gòu)建

制備乳腺生物反應(yīng)器關(guān)鍵是確保目標(biāo)蛋白特異性在乳腺中高效表示，外源基因在乳腺表示需要有一個(gè)引導(dǎo)泌乳期乳蛋白基因表示序列。傳統(tǒng)表示載體都是選取某種乳蛋白基因調(diào)控序列作為開啟子元件。這些基因調(diào)控區(qū)主要包含開啟子區(qū)、增強(qiáng)子序列和其它眾多轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)元件。細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第29頁

當(dāng)前用于表示載體開啟子調(diào)控元件主要有四類乳腺定位表示調(diào)控元件：第一類是B2乳球蛋白(BLG)，第二類是酪蛋白基因調(diào)控序列：第三類是乳清酸蛋白(WAP)基因調(diào)控序列；第四類是乳清白蛋白基因調(diào)控序列。

2023/4/20細(xì)胞工程30細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第30頁

當(dāng)前已克隆并用作構(gòu)建載體乳蛋白基因有：

β-乳球蛋白(BLG)基因、αSl-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳清酸蛋白(WAP)及乳清白蛋白基因。

反芻動物普通采取牛β-乳球蛋白（BLG）基因，該基因非常穩(wěn)定，并能在乳腺中特異性表示；家兔、豬和鼠類則采取乳清酸蛋白WAP

細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第31頁抗凝血藥品：抗凝血酶Ⅲ

第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)物。將半乳糖β-酪蛋白開啟子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相連，轉(zhuǎn)入綿羊胚胎細(xì)胞，在轉(zhuǎn)基因綿羊乳液中得到有生物活性抗凝血酶Ⅲ蛋白，產(chǎn)量可達(dá)7g/L。年6月2日上市。治療先天性抗凝血酶缺失癥病，我國年11月首次用乳腺生物反應(yīng)器取得抗凝血酶Ⅲ蛋白純品細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第32頁

α1-抗胰蛋白酶:

抑制肺氣腫釋放蛋白酶對肺組織破壞.

是一個(gè)利用BLG基因構(gòu)建重組蛋白。將BLG5末端4.0kb序列與人α1-抗胰蛋白酶（α1AT）基因6.5kb片段（去掉第一個(gè)內(nèi)含子）融合，再連接羊BLG開啟子，以pPOLYⅢ-Ⅰ為載體，轉(zhuǎn)入羊胚胎細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)基因羊分泌乳液中得到含量高達(dá)60.0mg/ml重組蛋白α1AT。細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第33頁

從轉(zhuǎn)基因羊羊奶中提取出治療心臟病藥品人組織型纖維蛋白溶酶原激活因子（tPA）。細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第34頁紅細(xì)胞生成素（EPO）

當(dāng)前國內(nèi)外均采取CHO細(xì)胞表示生產(chǎn)人EPO，成本比較昂貴，而用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)EPO，可能是一條理想路徑。將EPODNA分別以HindⅢ和BamHI酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收5.4kbHinⅢ/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+)載體，再將867bpβ-乳球蛋白（BLG）開啟子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位點(diǎn)，構(gòu)建表示載體pGEM-3zf(+)β-LG-EPO。經(jīng)過顯微注射方法得到轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中EPO含量可達(dá)0.5μg/ml。細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第35頁問題及展望

當(dāng)前，生產(chǎn)實(shí)踐中動物乳腺生物反應(yīng)器應(yīng)用已嶄露頭角，但這項(xiàng)技術(shù)還存在著眾多問題，※研發(fā)周期長、前期投資大及技術(shù)難度高等，造成全部產(chǎn)品都未商品化；※相關(guān)轉(zhuǎn)基因動物基礎(chǔ)理論研究還比較微弱；※乳腺生物反應(yīng)器異位表示和表示產(chǎn)物泄露問題也需要各種新技術(shù)來處理；※人們對