微生物限度檢查法專家講座

微生物限度檢查法微生物限度檢查法第1頁(yè)1．微生物程度檢驗(yàn)法意義藥品是防病治病、關(guān)系用藥者生命健康特殊商品，必須確保其質(zhì)量，用藥安全與有效。微生物污染藥品引發(fā)藥源性疾病屢見(jiàn)不鮮，在國(guó)內(nèi)外都有報(bào)道。為確保藥品質(zhì)量，必須對(duì)微生物污染進(jìn)行必要控制和檢驗(yàn)。其意義在于：已經(jīng)有許多實(shí)例表明，藥品污染微生物不但危及病人用藥安全，而且也直接影響藥品有效性，所以藥品衛(wèi)生質(zhì)量是藥品質(zhì)量不可分割部分。反應(yīng)藥品生產(chǎn)工藝科學(xué)性、合理性及質(zhì)量管理水平。經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)，凡工藝條件、生產(chǎn)管理水平、生產(chǎn)人員素質(zhì)差，不注意文明生產(chǎn)單位和企業(yè)，其生產(chǎn)藥品，染菌必定嚴(yán)重，不合格率無(wú)疑就高。微生物程度檢驗(yàn)是提供藥品衛(wèi)生質(zhì)量情況主要依據(jù)，因而確保銷售與使用過(guò)程中藥品有效性與安全性，是促進(jìn)與提升生產(chǎn)單位全方面質(zhì)量管理水平與提升藥品質(zhì)量主要依據(jù)。微生物程度檢驗(yàn)法概述微生物限度檢查法第2頁(yè)2．微生物程度檢驗(yàn)范圍依據(jù)藥品使用要求，可劃分為兩大類：要求滅菌藥品：包含注射劑和輸液劑，及用于體腔、嚴(yán)重?zé)齻?、潰瘍、出血及眼科用藥等制劑。非要求滅菌藥品：包含慣用口服制劑與普通外用制劑。對(duì)這一部分制劑普通不要求絕對(duì)無(wú)菌，允許一定限量微生物存在，但同時(shí)要求不得有可疑致病細(xì)菌存在。因?yàn)橹虏【秶軓V，各國(guó)藥典都要求了幾個(gè)常見(jiàn)致病菌或指標(biāo)菌作為控制菌。在非要求滅菌制劑中，對(duì)每克或每毫升藥品按劑型或品種不一樣要求：染菌量檢驗(yàn)：包含細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)測(cè)定，以檢驗(yàn)這幾類微生物對(duì)藥品污染程度?？刂凭鷻z驗(yàn)：包含大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌檢驗(yàn)等。微生物限度檢查法第3頁(yè)實(shí)

驗(yàn)

所

用

培

養(yǎng)

基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD）膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）

4－甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基（MUG）乳糖培養(yǎng)基5％乳糖培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基枸櫞酸鹽培養(yǎng)基曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）麥康凱瓊脂（MacC）營(yíng)養(yǎng)肉湯微生物限度檢查法第4頁(yè)微生物程度檢驗(yàn)慣用檢驗(yàn)設(shè)備及器材

恒溫培養(yǎng)箱30～35℃36±1℃霉菌培養(yǎng)箱25～28℃恒溫水浴箱45±1℃凈化工作臺(tái)生物顯微鏡1500X體視顯微鏡或放大鏡電冰箱電熱干燥箱250～300℃高壓蒸汽消毒器電子天平或藥品天平感量0.1g勻漿儀或研缽錐形瓶100ml，250ml，500ml，1000ml微生物限度檢查法第5頁(yè)直形吸管1ml，10ml量杯10ml試管18x180mm，13x200mm，30x200mm試管筒培養(yǎng)皿9cm培養(yǎng)皿筒陶瓦蓋12cm量筒100ml，500ml，1000ml濾器及微孔濾膜孔徑0.45±0.02um注射器1ml，5ml，10ml，30ml載玻片及蓋玻片接種針及接種環(huán)試管架微生物限度檢查法第6頁(yè)乙醇燈康氏振蕩器離心機(jī)500～4000／min紫外燈365nm玻璃或搪瓷消毒缸（帶蓋）大、小橡皮乳頭乙醇棉球或碘伏棉球滅菌剪刀、鑷子、鋼錐滅菌稱樣紙滅菌不銹鋼藥匙火柴、記號(hào)筆（玻璃鉛筆）白瓷盤、洗手盆試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)紙微生物限度檢查法第7頁(yè)細(xì)菌、霉菌與酵母菌檢驗(yàn)方法

（平皿菌落計(jì)數(shù)法）

（一）供試品抽樣、保留及檢驗(yàn)量1．

供試品應(yīng)隨機(jī)抽樣。普通抽樣量（2個(gè)以上最小包裝單位）為檢驗(yàn)量3倍量。2．對(duì)異常供試品應(yīng)針對(duì)性抽樣。抽樣時(shí)，凡發(fā)覺(jué)有異?；蚩梢蓸悠?，應(yīng)選取有疑問(wèn)樣品，但機(jī)械損傷、顯著破裂包裝不得作為樣品。凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）、外觀看出長(zhǎng)螨、發(fā)霉、蟲(chóng)蛀及變質(zhì)藥品，可直接判為不合格，無(wú)需在抽樣檢驗(yàn)。不能以外觀有上述情況而檢驗(yàn)內(nèi)容物合格，來(lái)判斷該藥品合格。3．供試品收檢后應(yīng)及時(shí)檢驗(yàn)，若有困難，應(yīng)存放在該品種要求儲(chǔ)存條件下（普通為陰涼干燥處），勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保留條件不妥引發(fā)致死、損傷或繁殖。微生物限度檢查法第8頁(yè)4．供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，禁止開(kāi)啟，包裝已開(kāi)啟樣品不得作為供試品。5．供試品取樣必須在凈化條件下無(wú)菌操作，嚴(yán)防再污染。（原料藥、裝量大藥）6．有劑型檢驗(yàn)量均需取自2個(gè)以上包裝單位（中藥蜜丸、膜劑，除需取自2個(gè)以上包裝外，還應(yīng)取4丸、片以上樣品）。7．固體及半固體（粘稠性供試品）制劑檢驗(yàn)量為10克。8．液體制劑檢驗(yàn)量為10毫升。9．膜劑除另有要求外，中藥膜劑檢驗(yàn)量為30～50cm2

，化學(xué)膜劑及生化藥膜劑檢驗(yàn)量為100cm2

。10．珍貴或微量包裝供試品檢驗(yàn)量能夠酌減，除另有要求外，口服固體制劑不低于3克，液體制劑采取原液者不得少于6毫升，采取供試液者不得少于3毫升，外用藥品不得少于5克6微生物限度檢查法第9頁(yè)（二）試驗(yàn)操作前準(zhǔn)備

1．將供試品及全部已滅菌平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、研缽、吸管（1ml10ml）、量筒、稀釋劑等移至無(wú)菌室內(nèi)。每次試驗(yàn)所用物品必須事先計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，防止操作中出入操作間。編號(hào)后將全部外包裝（牛皮紙、布）取掉。另外還有增菌液、培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，保持在45℃左右水浴中）、MUG培養(yǎng)基試管等……………..濕熱滅菌物品稱量紙、手術(shù)鑷子、剪子等…………...干熱滅菌物品

2．開(kāi)啟無(wú)菌室紫外殺菌燈和空氣凈化裝置，并使其工作不少于30分鐘。

3．操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外殺菌燈，進(jìn)入緩沖間，換工作鞋。再用0.1％苯扎溴銨溶液或其它消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無(wú)菌衣、帽、口罩。微生物限度檢查法第10頁(yè)

4．操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等開(kāi)口處周圍，待干后用滅菌手術(shù)鑷或剪將供試品啟封。（三）供試液制備（1：10供試液）按供試品理化特征與生物學(xué)特征采取適宜方法制備供試液。不得改變污染微生物數(shù)量和種類。

1．液體供試品取供試品10ml，加入到稀釋劑90ml中，混勻，作為供試液。（有書(shū)上講取10ml，置滅菌錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，搖勻）。①

油劑可加適量聚山梨酯－80；微生物限度檢查法第11頁(yè)

②氣霧劑、噴霧劑供試品將供試品置冰室內(nèi)2hr后，取出，用滅菌鋼錐小心鉆孔，使拋射劑遲緩釋放，然后用滅菌注射器加入稀釋劑，混勻后吸收相當(dāng)于10g或10ml供試品，再稀釋成1：10供試液。USPXXIV要求是拋射劑導(dǎo)出后，吸收10ml或取10g供試品，加稀釋液使成100ml。③合劑（系指含蜂蜜或王漿者）與滴眼劑可用供試品作為供試液。（滴眼劑不得檢出霉菌和酵母菌）。含蜂蜜、王漿制劑2．固體、半固體或粘稠供試品稱取供試品10g，置裝有0.9％無(wú)菌氯化鈉100ml勻漿杯中，用勻漿儀（3000～5000r／2－4min），或其它適宜方法（振蕩器或研缽研磨等方法分散混勻，作為供試液。在制備過(guò)程中，必要時(shí)可加適量聚山梨酯－80，并適當(dāng)加溫，但不應(yīng)超出45℃。微生物限度檢查法第12頁(yè)3．非水溶性供試品①軟膏劑、乳化劑稱取供試品5g(5ml)，加入含已滅菌熔化并保溫45℃左右司盤－8050g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯－8010g混合物燒杯中，用無(wú)菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45℃左右0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液約80ml，（實(shí)際測(cè)可能是85ml），邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為供試液（1：20）。②油劑取供試品10ml，加入無(wú)菌聚山梨酯－805～8ml，搖勻，再加入稀釋劑至100ml。③栓劑稱取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑，置45℃左右水浴保溫10min，使溶，加入無(wú)菌聚山梨酯－805～8ml，振搖使之乳化，再加稀釋劑（稀釋劑和聚山梨酯－80總量為100ml），搖勻微生物限度檢查法第13頁(yè)④

茶劑取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖30秒，以滅菌紗布過(guò)濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結(jié)果按1：10加稀釋劑，浸泡30分鐘）。⑤

膠丸劑（如魚(yú)肝油丸等）同膠囊劑⑥

膠劑（如阿膠）取膠劑若干，搗碎，稱取10g，再用研缽研細(xì)，轉(zhuǎn)入250ml錐形瓶?jī)?nèi)，加入稀釋劑100ml，置45℃±1℃水浴中，振搖使溶，即為1：10供試液。⑦膠丸劑（如魚(yú)肝油丸等）同膠囊劑⑧

膠劑（如阿膠）取膠劑若干，搗碎，稱取10g，再用研缽研細(xì)，轉(zhuǎn)入250ml錐形瓶?jī)?nèi)，加入稀釋劑100ml，置45℃±1℃水浴中，振搖使溶，即為1：10供試液。微生物限度檢查法第14頁(yè)

4．含抑菌成份供試品（僅限檢驗(yàn)控制菌時(shí)用）凡含防腐劑或抑菌成份且影響檢驗(yàn)（供試品按常規(guī)檢驗(yàn)法，加入要求量對(duì)照菌，不能檢出時(shí)）供試品，可依據(jù)供試品性質(zhì)，控制菌特征及檢驗(yàn)條件等按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合應(yīng)用處理后，依法檢驗(yàn)。同時(shí)做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。藥典要求：供試品如干擾控制菌檢驗(yàn)，按以下方法處理后，依法檢驗(yàn)。實(shí)際操作中：先把供試液離心（500r/min5min）這么菌體在上層，吸收上清液過(guò)濾，把濾膜直接貼在培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可，詳細(xì)吸收上清液10ml還是100ml按品種要求自己定。取10ml過(guò)濾測(cè)出來(lái)是個(gè)／克，取100ml過(guò)濾測(cè)出來(lái)是個(gè)／10克。（程度檢驗(yàn)）①稀釋法：將供試品種入較大量培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用濃度（使該供試液稀釋至陽(yáng)性對(duì)照菌能生長(zhǎng)濃度）。此法用作控制菌檢驗(yàn)和程度檢驗(yàn)。本法適合用于抑菌作用不強(qiáng)中藥、化學(xué)藥品檢驗(yàn)。微生物限度檢查法第15頁(yè)②離心沉淀集菌法：取要求量供試液于無(wú)菌刻度離心管中，離心（每分鐘3000轉(zhuǎn)）30分鐘，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，再稀釋成原要求供試液。如有不溶性藥渣，可先離心（每分鐘500轉(zhuǎn)）5分鐘，取全部上層液，再行集菌處理。本法適合用于一些抑菌作用不強(qiáng)中、西藥品，如蜜丸、水丸、片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑及液體制劑。應(yīng)用本法需嚴(yán)防操作污染，并注意上層液或上清液和底部殘?jiān)蛛x，防止沉渣混入其中。③薄膜過(guò)濾法：取要求量供試液，置稀釋劑100ml中，搖勻，以無(wú)菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑小于0.45um±0.02um微孔濾膜過(guò)濾器中，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗濾膜3次，每次50～100ml，取出濾膜備檢。沖洗時(shí)每次最好不少于100ml，能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基加入濾器或取出濾膜，加入增菌培養(yǎng)基中，能夠用加入濾器中供試品量來(lái)控制檢驗(yàn)量，也能夠把濾膜取出來(lái)剪成2～4片，使每片相當(dāng)于供試品1g或1ml，放入增菌培養(yǎng)基中，作控制菌檢驗(yàn)。微生物限度檢查法第16頁(yè)本法適合用于水溶性抑菌成份中、西藥品和滴眼劑等制劑“滅活”處理。安放濾膜時(shí)，注意濾膜與濾器應(yīng)密合，預(yù)防濾膜破損、漏液。本法所用濾膜孔徑0.45um±0.02um。④（鈍化）中和法：凡含磺胺、汞、砷類或防腐劑供試品，可用對(duì)應(yīng)試劑鈍化活性因子，中和毒性后制成供試液。磺胺類藥品中和法取要求量含磺胺類供試品，于100ml增菌液中加入含1％對(duì)氨基苯甲酸約1～5ml（以前講加入0.5ml）。本法用于含磺胺較少制劑，如：三黃軟膏、消炎眼藥水、斑馬眼藥水等。應(yīng)用本法可因供試品不一樣，對(duì)氨基苯甲酸用量可適當(dāng)調(diào)整。含砷、汞等重金屬藥品中和法，取要求量供試品，加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml中，作增菌培養(yǎng)。微生物限度檢查法第17頁(yè)本法適合用于含重金屬鹽類藥品檢驗(yàn)，如磺胺嘧啶銀軟膏等。含洗必泰等防腐劑供試品中和法，取要求量供試品，加入含適量聚山梨酯－80等表面活性劑100ml增菌液中（表面活性劑用量應(yīng)預(yù)試，用量過(guò)大有抑菌作用）。本法適合用于洗必泰含片、洗必泰栓、霉滴栓劑及其它含抑菌成份供試品。應(yīng)用本法需注意，因?yàn)楣┰嚻凡灰粯?，表面活性劑用量?yīng)預(yù)試，用量不宜過(guò)大，不然本身易產(chǎn)生抑菌作用。⑤沉降法：（藥典上沒(méi)收載此法）取要求量供試液，自然沉降5分鐘，取上層液于100ml增菌液中，作增菌培養(yǎng)。本法用于單一成份固體制劑如磺胺嘧啶片。取要求量供試液，自然沉降5分鐘，吸收上層液于（含1％對(duì)氨基苯甲酸1ml）100ml增菌液中，作增菌培養(yǎng)。本法適合用于復(fù)方磺胺制劑，如復(fù)方磺胺嘧啶片、復(fù)方新諾明片等微生物限度檢查法第18頁(yè)以上兩法適合用于難溶于水抗菌制劑。如磺胺類藥應(yīng)用沉降法時(shí)，供試品應(yīng)充分研細(xì)，并與稀釋劑充分搖勻，使污染菌分散于液相中；沉降時(shí)間不宜超出5分鐘，以防菌細(xì)胞下沉；取上清液時(shí)，防止吸入藥渣。（四）對(duì)照用陽(yáng)性菌液控制菌檢驗(yàn)均應(yīng)作對(duì)應(yīng)已知菌陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。對(duì)照菌株為大腸桿菌［CMCC(B)44102］、沙門菌CMCC(B)50094］、銅綠假單胞菌、［CMCC(B)10104］及金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]制備：取對(duì)應(yīng)菌株?duì)I養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18～20小時(shí)后，稀釋至1：106。對(duì)照菌加入量為50～100個(gè)。CMCC――醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心。國(guó)內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用菌種主要是CMCC(B)、CMCC(F)菌號(hào)，B(bacteria)代表細(xì)菌，F(xiàn)(fungi)代表真菌。中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供這些干燥菌種。微生物限度檢查法第19頁(yè)（五）平皿菌落計(jì)數(shù)法取均勻供試液，深入稀釋成1：1021：103等適宜稀釋級(jí)。分別取連續(xù)三級(jí)10倍稀釋供試品液各1ml，置直徑約9mm平皿中，再注入約45℃培養(yǎng)基約15ml，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)，每稀釋級(jí)應(yīng)作2～3個(gè)平皿。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計(jì)數(shù)。在特殊情況下，前者同時(shí)點(diǎn)記霉菌、酵母菌菌落數(shù)，后者同時(shí)點(diǎn)記細(xì)菌菌落數(shù)。酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)。含蜂蜜、王漿制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基與酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分別測(cè)定霉菌、酵母菌菌落數(shù)，合并計(jì)數(shù)。含糖液體及半固體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基同時(shí)點(diǎn)計(jì)霉菌菌落數(shù)及酵母菌菌落數(shù)。（六）菌數(shù)測(cè)定陰性對(duì)照試驗(yàn)取供試驗(yàn)用稀釋劑各1ml，置4個(gè)無(wú)菌平皿中，分別按細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢驗(yàn)，不得長(zhǎng)菌。（七）檢驗(yàn)程序微生物限度檢查法第20頁(yè)細(xì)菌、霉菌（酵母菌）檢驗(yàn)程序

微生物限度檢查法第21頁(yè)

（八）供試液稀釋（10倍遞增稀釋法）

取2～3支滅菌試管，分別加入9ml滅菌稀釋劑。另取1支1ml滅菌吸管吸收1：10均勻供試液1ml，加入裝有9ml滅菌稀釋劑試管中混勻，即得1：100供試液。依這類推，依據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1：103、1：104等適宜稀釋級(jí)（最少共三級(jí)）。普通取1：101：1021：103三級(jí)稀釋液檢驗(yàn)。每遞增一個(gè)稀釋級(jí)，必須另?yè)Q一支吸管。在作10倍遞增稀釋時(shí)，吸管插入第1級(jí)稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm，重復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，再沿第2支稀釋管內(nèi)壁靠近液面（勿接觸液面）遲緩地吹出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無(wú)粘附或殘留液體），然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。微生物限度檢查法第22頁(yè)（九）注平皿在進(jìn)行10倍遞增稀釋同時(shí)，以該稀釋級(jí)吸管，吸收各級(jí)稀釋液各1ml至每個(gè)平皿中，每一稀釋劑注2～3個(gè)平皿。（此時(shí)，普通為左手執(zhí)平皿，將蓋半開(kāi)，右手執(zhí)吸管），注平皿時(shí)，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無(wú)殘留液體，預(yù)防反流到吸管尖端部。同時(shí)做陰性對(duì)照（待各級(jí)稀釋液注皿完成后，用一支1ml吸管吸收稀釋劑各1ml，分別注入4個(gè)平皿中。其中兩個(gè)作細(xì)菌陰性對(duì)照；另2個(gè)作霉菌、酵母菌陰性對(duì)照，如另用YPD瓊脂測(cè)定酵母菌數(shù)時(shí)，再增加2個(gè)平皿作酵母菌數(shù)陰性對(duì)照）。（十）傾注培養(yǎng)基將預(yù)先配制好培養(yǎng)基（細(xì)菌計(jì)數(shù)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂，霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)普通用玫瑰紅鈉瓊脂，含蜂蜜、王漿液體制劑另加用YPD瓊脂）溶化，冷至約45℃時(shí)，微生物限度檢查法第23頁(yè)傾注上述各個(gè)平皿約15ml，以順時(shí)針或反時(shí)針?lè)较蚩焖傩D(zhuǎn)平皿，使試液與培養(yǎng)基混勻，（注意，混勻時(shí)切勿將培養(yǎng)基濺到平皿邊及皿蓋上），置操作臺(tái)上待凝。（十一）培養(yǎng)細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)平板于25～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。（十二）菌落計(jì)數(shù)1．細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)，分別在24小時(shí)及48小時(shí)點(diǎn)記菌落數(shù)，普通以48小時(shí)菌落數(shù)為準(zhǔn)，霉菌、酵母菌培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)，分別在48小時(shí)及72小時(shí)點(diǎn)記菌落數(shù)，普通以72小時(shí)菌落數(shù)為準(zhǔn)。菌落如蔓延生長(zhǎng)成片，此平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)后，計(jì)算各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)，按菌數(shù)匯報(bào)規(guī)則匯報(bào)菌數(shù)。微生物限度檢查法第24頁(yè)2．普通將平皿置菌落計(jì)數(shù)器或從平皿后面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察。勿漏計(jì)細(xì)小瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長(zhǎng)菌落。注意細(xì)菌菌落與霉菌菌落和酵母菌菌落以及它們與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等區(qū)分。必要時(shí)用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。如仍難區(qū)分，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間4～7天，細(xì)菌菌落常會(huì)生長(zhǎng)增大而加以區(qū)分。3．供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌落排除，不可點(diǎn)記在細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除方法須按該制劑微生物品種而定，并須觀察菌落特征及染色形態(tài)。4．供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，（尤其是1：10級(jí)別）培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后有時(shí)形成數(shù)量很多且難與菌落用肉眼相區(qū)分有形物。為了有利于菌落計(jì)數(shù)，可在操作時(shí)將適宜稀釋級(jí)供試液多增加注皿微生物限度檢查法第25頁(yè)（1～2個(gè)平皿），注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（勿結(jié)凍）中，在計(jì)數(shù)菌落時(shí)作為對(duì)照?；蛴?.001％TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后可將細(xì)菌菌落與其它有形物區(qū)分開(kāi)來(lái)。［0.001%TTC肉湯瓊脂培養(yǎng)基（0.001%2、3、5氯化三苯四氮唑瓊脂），在每1000ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌1％TTC溶液1ml混勻后傾注平皿，預(yù)防菌落蔓延］。有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長(zhǎng)菌落不易識(shí)別和點(diǎn)計(jì)，為預(yù)防這種情況，也可用0.001％TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后生長(zhǎng)菌落為紅色，襯以白色背景上易于點(diǎn)計(jì)。5．若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上菌落重合，肉眼可區(qū)分時(shí)仍以2個(gè)菌落或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)；若平板生長(zhǎng)有鏈狀菌落，菌落間無(wú)顯著界限，一條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)，但若鏈上出現(xiàn)性狀與鏈狀菌落不一樣可辨菌落時(shí)，仍應(yīng)分別計(jì)數(shù)，若生長(zhǎng)蔓延較大片狀菌落或花斑樣菌落，普通不宜作為計(jì)數(shù)用。微生物限度檢查法第26頁(yè)附表：細(xì)菌、霉菌、酵母菌形態(tài)特征比較（營(yíng)養(yǎng)瓊脂及玫瑰紅鈉瓊脂平板）

微生物限度檢查法第27頁(yè)

6．如同一稀釋級(jí)2個(gè)平板菌落數(shù)超出1倍以上，不應(yīng)計(jì)數(shù)，菌落蔓延成片不應(yīng)計(jì)數(shù)。7．當(dāng)2個(gè)平板菌落數(shù)均在15（含15）以下時(shí)，按菌落計(jì)數(shù)Poisson分布菌數(shù)95%可信限計(jì)。二個(gè)平板最大差值分別在0～4，1～7，2～9，3～10，4～12，5～14，6～15，以上各數(shù)分別為菌落平均值1、2、3、4、5、6、7上限及下限，超出以上程度，視為操作誤差，不得作為計(jì)數(shù)依據(jù)。每個(gè)稀釋級(jí)使用3個(gè)平板時(shí)，平板菌落數(shù)均在10個(gè)以下情況。0～3，1～5，2～7，3～9，4～10，5～12，6～13，7～14。

8．對(duì)有疑議供試品以YPD培養(yǎng)基作酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，可培養(yǎng)至1周再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。（十三）菌數(shù)匯報(bào)規(guī)則

1．細(xì)菌數(shù)選取平均菌落數(shù)在30～300（國(guó)外近年有選取25～250趨向）之間稀釋級(jí)，霉菌、酵母菌選取平均菌落數(shù)在30～100之間稀釋級(jí)作為匯報(bào)菌微生物限度檢查法第28頁(yè)數(shù)計(jì)算依據(jù)。如只有1個(gè)稀釋級(jí)平均菌落數(shù)在30～300（30～100）之間，則將該稀釋級(jí)菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報(bào)。

2．如有2個(gè)相鄰稀釋級(jí)平均菌落數(shù)在30～300（30～100）之間時(shí)，則按比值計(jì)算。當(dāng)比值≤2時(shí)，則以2個(gè)稀釋級(jí)均值匯報(bào)。當(dāng)比值＞2時(shí)，則以低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報(bào)。比值＝（高稀釋級(jí)平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）／（低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）

3．如有3個(gè)稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在30～300（30～100）之間時(shí)，則以后2個(gè)稀釋級(jí)計(jì)算級(jí)間比值匯報(bào)。

4．如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在300（100）以上，則按最高稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報(bào)；如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在30以下，普通則按最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報(bào)。微生物限度檢查法第29頁(yè)

5．如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均不在30～300（30～100）之間，則以最靠近30或300（100）稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報(bào)。

6．如各稀釋劑平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)或僅最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)小于1時(shí)，則匯報(bào)菌數(shù)為小于10個(gè)／g或ml。如供試品原液平板均未生長(zhǎng)霉菌及酵母菌，則匯報(bào)未檢出霉菌及酵母菌／ml。

7．當(dāng)各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均小于30時(shí)，如高稀釋級(jí)平均菌落數(shù)大于或等于低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)時(shí)，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法重新測(cè)定，按測(cè)定結(jié)果匯報(bào)菌數(shù)。

培養(yǎng)基稀釋法：取低稀釋級(jí)供試液（原液或1：10供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個(gè)或5個(gè)以上平皿中（每皿0.2ml或＜0.2ml)，每1個(gè)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。5個(gè)或5個(gè)以上平板點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)之和，即為每1ml菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)。以3份低稀釋級(jí)供試液菌落數(shù)平均值乘以稀釋倍數(shù)匯報(bào)。微生物限度檢查法第30頁(yè)8．結(jié)果匯報(bào)①

菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)匯報(bào)。②

菌落數(shù)大于100時(shí)，取兩位有效數(shù)字匯報(bào)，第三位按數(shù)值修約規(guī)則處理。③

復(fù)試供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)其中任一項(xiàng)一次檢驗(yàn)不合格，應(yīng)重新取2倍包裝量供試品，依法作單項(xiàng)復(fù)試兩份，以三次檢驗(yàn)結(jié)果平均值匯報(bào)。微生物限度檢查法第31頁(yè)（十四）注意事項(xiàng)1．供試品檢驗(yàn)全過(guò)程必須符合無(wú)菌技術(shù)要求。使用滅菌用具時(shí)，不能接觸可能污染任何器物，滅菌吸管不得用口吹吸。2．從供試品稀釋至傾注瓊脂培養(yǎng)基操作應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成，防止因?yàn)闀r(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成菌細(xì)胞繁殖或死亡。3．供試液稀釋及注皿應(yīng)取均勻供試液，以免造成試驗(yàn)誤差。4．為防止細(xì)菌菌落蔓延生長(zhǎng)，宜采取以下方法處理：開(kāi)蓋干燥換陶瓦蓋加TTC(0.001%)5．在凈化工作臺(tái)上操作時(shí)，應(yīng)防止雙手往返出入工作臺(tái)；在無(wú)菌室操作時(shí)，應(yīng)防止操作者往返出入無(wú)菌室。

微生物限度檢查法第32頁(yè)細(xì)菌、霉菌及酵母菌其它檢驗(yàn)方法

（一）

細(xì)菌計(jì)數(shù)其它測(cè)定方法細(xì)菌計(jì)數(shù)除平板菌落計(jì)數(shù)法外，還有其它方法，大致上可分兩大類：1．活菌計(jì)數(shù)包含試管稀釋法、濾膜法、毛細(xì)血管法等前者是液體培養(yǎng)法，后二者是固體培養(yǎng)法。其特點(diǎn)都是檢測(cè)含有繁殖能力細(xì)菌數(shù)。2．總菌數(shù)計(jì)數(shù)法是以細(xì)菌（或其它菌類）形態(tài)特征檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)，包含無(wú)生殖能力菌細(xì)胞在內(nèi)。試管稀釋法（試管法、MPN法）微生物限度檢查法第33頁(yè)濾膜法（BP、JP已收載此法）計(jì)數(shù)板法（采取血球計(jì)數(shù)板或其它計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)）儀器法（應(yīng)用儀器測(cè)定菌數(shù)是當(dāng)代菌數(shù)檢測(cè)技術(shù)一個(gè)發(fā)展動(dòng)向。細(xì)菌細(xì)胞則屬不導(dǎo)電粒子，可被計(jì)數(shù)）平板涂布法（二）

霉菌、酵母菌數(shù)測(cè)定其它方法1．表面涂抹平板法本法適合用于污染比較嚴(yán)重供試品2．濾膜培養(yǎng)法3．酵母菌鏡檢計(jì)數(shù)法血球計(jì)數(shù)板或其它計(jì)數(shù)板進(jìn)行酵母菌計(jì)數(shù)

微生物限度檢查法第34頁(yè)大

腸

桿

菌

檢

查

法

大腸桿菌即大腸埃希菌(Escherichiacoli)，為腸桿菌科埃希菌屬模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)覺(jué)有非脫羧埃希菌等四個(gè)種（有資料說(shuō)五種）。大腸埃希菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸桿菌，表明該樣品受到了人和溫血?jiǎng)游锛S便污染，即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸桿菌外還有致病性大腸桿菌，可引發(fā)嬰幼兒、成人暴發(fā)性腹瀉。為確保人體健康，口服藥品必須檢驗(yàn)大腸桿菌。用4－甲基傘形酮葡糖苷酸(4－Methylumbelliferyl－β－D－glucuronide，即MUG)和靛基質(zhì)（Indole）試驗(yàn)檢驗(yàn)大腸桿菌是一項(xiàng)新技術(shù)，專一性強(qiáng)，試驗(yàn)證實(shí)94％大腸埃希菌MUG陽(yáng)性，且在大腸埃希菌屬中，除E.coli以外，其它5種微生物限度檢查法第35頁(yè)大腸埃希桿菌MUG皆為陰性。其檢驗(yàn)步驟為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌種分離單個(gè)菌，如MUG、Indole試驗(yàn)為陽(yáng)性或陰性即可匯報(bào)結(jié)果，如MUG、Indole試驗(yàn)不一致時(shí)，則需分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化試驗(yàn)判別。原理：利用目標(biāo)菌限定酶作用低物水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應(yīng)作為指標(biāo)系統(tǒng)來(lái)判定目標(biāo)菌。試驗(yàn)證實(shí)96％大腸桿菌含β－葡糖苷酸酶（β－glucuronidase,GUD），約10％沙門菌屬一些菌種也含有此酶。MUG被GUD水解，產(chǎn)生熒光，因?yàn)闊晒夥磻?yīng)敏感度較顏色反應(yīng)強(qiáng)千萬(wàn)倍，易于觀察，沒(méi)有主觀性，因而用MUG判定大腸桿菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等檢測(cè)。單一MUG判別大腸桿菌其漏檢率達(dá)6％，這不符合藥典檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確度要求，鑒于98％大腸桿菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽(yáng)性，故將MUG－靛基質(zhì)試驗(yàn)結(jié)合，用EMB瓊脂平板分離，輔以IMViC試驗(yàn)，在理論上可使大腸桿菌檢出率達(dá)99％。微生物限度檢查法第36頁(yè)（一）大腸桿菌檢驗(yàn)程序（見(jiàn)下頁(yè)圖表）供試液制備方法：1．液體供試品

2．固體、半固體或粘稠液體供試品

3．非水溶性供試品

4．含抑菌成份供試品（稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法、沉降法）（二）增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基3份，每份各100ml，2份分別加入要求量供試液，其中1份加入對(duì)照菌50～100個(gè)作陽(yáng)性對(duì)照，第3份加入與供試液等量稀釋劑作陰性對(duì)照。37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)（必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)）。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。微生物限度檢查法第37頁(yè)搖勻上述膽鹽乳糖增菌液，以滅菌吸管吸收供試品膽鹽乳糖增菌液、供試品陽(yáng)性對(duì)照增菌液、陰性對(duì)照培養(yǎng)液各0.2ml，分別加入5mlMUG－蛋白胨培養(yǎng)基管，37℃培養(yǎng)，分別于5小時(shí)、24小時(shí)，取未接種MUG培養(yǎng)基管作本底對(duì)照，將各管置365nm紫外燈下觀察。陽(yáng)性對(duì)照管展現(xiàn)熒光，MUG陽(yáng)性，供試液MUG管展現(xiàn)熒光，MUG陽(yáng)性；無(wú)熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。（三）分離培養(yǎng)如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性時(shí)，將上述供試品BL微生物限度檢查法第38頁(yè)大

腸

桿

菌

檢

驗(yàn)

程

序

圖

示

微生物限度檢查法第39頁(yè)

增菌液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。當(dāng)陰性對(duì)照呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照平板呈經(jīng)典菌落生長(zhǎng)時(shí)，如上述供試液培養(yǎng)物分離平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，判未檢出大腸桿菌。假如有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑選2～3個(gè)可疑菌落作靛基質(zhì)試驗(yàn)（I）、甲基紅試驗(yàn)（M）、乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V－P）、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）及革蘭染色，鏡檢。按表中要求判斷結(jié)果：（見(jiàn)下頁(yè)）微生物限度檢查法第40頁(yè)大腸桿菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)

曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）經(jīng)典菌落呈紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，有金屬光澤。非經(jīng)典菌落呈淺紫色、粉紅色，或菌落中心紫色或無(wú)顯著暗色中心，無(wú)金屬光澤。麥康凱瓊脂

經(jīng)典菌落呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。非經(jīng)典菌落呈微紅色，或菌落中心呈紅色。

微生物限度檢查法第41頁(yè)（四）純培養(yǎng)（復(fù)壯）如生長(zhǎng)菌落與（大腸桿菌菌落形態(tài)特征表）所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選2～3個(gè)以上疑似菌落，分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～24小時(shí)，作以下檢驗(yàn)。如平板上無(wú)單個(gè)可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18～24小時(shí)，在挑選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢驗(yàn)。（五）革蘭染色、鏡檢

1．以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，輕輕研開(kāi)，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再經(jīng)過(guò)火焰2～3次（載玻片不燙手為宜）固定。微生物限度檢查法第42頁(yè)2．滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘，水洗3．滴加碘液，媒染1分鐘，水洗，以濾紙吸干余水4．滴加95％乙醇，脫色20～30秒，水洗?；?qū)?5％乙醇滴滿整個(gè)涂片，馬上傾去，再用乙醇滴滿涂片脫色10秒，水洗、吸干5．滴加沙黃染液，復(fù)染1分鐘，待干后，鏡檢染色結(jié)果：革蘭陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸桿菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。注意事項(xiàng)：

1．玻片必須潔凈，涂片菌量宜少，菌量不可濃，不然，菌細(xì)胞成堆或連成片?？床磺鍐蝹€(gè)菌體形態(tài)。染色反應(yīng)難于判斷，菌細(xì)胞形態(tài)難于觀察。

2．待檢菌菌齡以16～24小時(shí)為宜。革蘭陽(yáng)性菌易受菌齡影響，老化細(xì)胞易呈陰性。

3．脫色是本法關(guān)鍵步驟，脫色時(shí)間不足菌細(xì)胞易染成陽(yáng)性，脫色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易染成陰性。微生物限度檢查法第43頁(yè)（六）生化試驗(yàn)

1．靛基質(zhì)試驗(yàn)（I）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48小時(shí)，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)試管，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。98％大腸桿菌I試驗(yàn)為陽(yáng)性。普通24小時(shí)即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，以無(wú)菌操作先從管中取出1ml或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢驗(yàn)，如靛基質(zhì)試驗(yàn)是陰性，余下蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24小時(shí)，作靛基質(zhì)試驗(yàn)。

2．甲基紅試驗(yàn)(M)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時(shí)±2小時(shí)，于管內(nèi)加入甲基紅指示液2～3滴（約每1ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動(dòng)，馬上觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。微生物限度檢查法第44頁(yè)

3．乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)(V－P)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時(shí)±2小時(shí)，于每2ml培養(yǎng)液中加入α－萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40％KOH溶液0.4ml，充分振搖，在4小時(shí)（通常在30min）內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽(yáng)性，無(wú)紅色反應(yīng)為陰性。

4．枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(C)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，普通培養(yǎng)48～72小時(shí)，培養(yǎng)基斜面有菌落生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色無(wú)改變?yōu)殛幮?。（七）注意事?xiàng)

1．本法（MUG法）無(wú)須從混合菌中分離單個(gè)菌落。除大腸埃希菌外，還有部分志賀菌屬、沙門菌屬菌株；亦有極少數(shù)革蘭陽(yáng)性球菌、桿菌和芽孢菌，其MUG為陽(yáng)性。所以在MUG培養(yǎng)基成份中增加了去氧膽酸鈉，可排除革蘭陽(yáng)性微生物限度檢查法第45頁(yè)菌干擾。至于志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長(zhǎng)，即使有生長(zhǎng)，本法能檢出。既然藥品中不得檢出大腸桿菌，更不允許檢出志賀菌、沙門菌。

2．配制MUG培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必校正PH值，滅菌后PH不得過(guò)7.4，不然PH值偏高，MUG管本身分解則顯熒光，分裝MUG培養(yǎng)基試管應(yīng)挑選，試管本身不得顯熒光。

3．培養(yǎng)時(shí)間供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間，普通在5小時(shí)、24小時(shí)觀察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準(zhǔn)確判斷時(shí)，可延長(zhǎng)培養(yǎng)至48小時(shí)再觀察結(jié)果。因?yàn)榇竽c埃希菌各菌株間GUD（β－葡萄糖醛酸苷酶）活性不完全相同，對(duì)低物和低物濃度反應(yīng)差異；培養(yǎng)基中選擇因子影響；培養(yǎng)時(shí)間、溫度；PH改變；大量競(jìng)爭(zhēng)菌和樣品本身物質(zhì)成份干擾等，對(duì)結(jié)果判斷亦有影響。微生物限度檢查法第46頁(yè)

4．結(jié)果觀察取供試品MUG試驗(yàn)管、陽(yáng)性對(duì)照管、陰性對(duì)照管同時(shí)在365nm紫外燈下觀察，陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)有較強(qiáng)藍(lán)白色熒光，陰性對(duì)照管無(wú)熒光。供試品MUG管是否有熒光，應(yīng)仔細(xì)觀察比較，或?qū)⒏鞴苷{(diào)換位置（陰性管居中間），適當(dāng)傾斜試管。如陽(yáng)性對(duì)照管熒光強(qiáng)烈，影響供試品管與陰性對(duì)照管觀察時(shí)，亦可移去陽(yáng)性對(duì)照管。

5．藥品中污染大腸桿菌，亦受生產(chǎn)工藝及藥品影響。在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂平板上菌落形態(tài)特征時(shí)有改變，挑取可疑菌落往往憑經(jīng)驗(yàn)，主觀性較大，務(wù)必挑選2～3個(gè)以上菌落分別做IMViC試驗(yàn)判別，挑選菌落越多，檢出陽(yáng)性菌機(jī)率越高，如僅挑選一個(gè)菌落做IMViC試驗(yàn)判別，則易漏檢。微生物限度檢查法第47頁(yè)

6．在IMViC試驗(yàn)中，以滅菌接種針沾取菌苔，首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中。且勿將培養(yǎng)基帶入枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。枸櫞酸鹽利用培養(yǎng)時(shí)間，原定為2天，依據(jù)試驗(yàn)資料，發(fā)覺(jué)培養(yǎng)3天后，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)產(chǎn)生陽(yáng)性。僅培養(yǎng)2天是不夠，故試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間改為2～4天（藥典要求48～72小時(shí)）。

7．陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)是檢驗(yàn)供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜。陽(yáng)性對(duì)照菌液制備、計(jì)數(shù)及加入含供試品培養(yǎng)基中等操作，不能在檢測(cè)供試品無(wú)菌室或凈化臺(tái)上進(jìn)行，必須在單獨(dú)隔離間或凈化臺(tái)操作，以免污染供試品及操作環(huán)境。微生物限度檢查法第48頁(yè)8．在各類供試品中檢測(cè)大腸桿菌及其它控制菌，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)驗(yàn)。檢出大腸桿菌及其它控制菌培養(yǎng)物須保留備查。（普通保留1個(gè)月）

9．大腸埃希桿菌（E.coli）是大腸埃希桿菌屬中一個(gè)細(xì)菌，已知大腸埃希菌屬有6種，其中IMViC試驗(yàn)?zāi)Ｊ綖椋D―或－＋――。故中國(guó)藥典大腸埃希桿菌檢驗(yàn)法所指IMViC試驗(yàn)結(jié)果與BP1998E.coli檢驗(yàn)法比較，判斷檢出或未檢出大腸埃希桿菌，都有其不足。

BP1998法中含IMViC試驗(yàn)為＋＋――菌株但BP1998法中不含IMViC試驗(yàn)為－＋――菌株微生物限度檢查法第49頁(yè)附：經(jīng)典大腸桿菌＋＋――

非經(jīng)典大腸桿菌－＋――

經(jīng)典中間型大腸桿菌＋＋―＋非經(jīng)典中間型大腸桿菌－＋―＋經(jīng)典產(chǎn)氣腸桿菌――＋＋非經(jīng)典產(chǎn)氣腸桿菌＋―＋＋

微生物限度檢查法第50頁(yè)沙門菌檢驗(yàn)法

（見(jiàn)

頁(yè)）

銅綠假單胞菌檢驗(yàn)法（見(jiàn)

頁(yè)）

金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)法（見(jiàn)頁(yè)）

破傷風(fēng)梭菌檢驗(yàn)法

（見(jiàn)

頁(yè)）

微生物限度檢查法第51頁(yè)微生物程度檢驗(yàn)法結(jié)果判斷

（一）細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌（酵母菌）菌落數(shù)、控制菌三項(xiàng)均符合該品種微生物程度項(xiàng)下要求，應(yīng)判為供試品符合要求；其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下要求，應(yīng)判供試品不合格。（二）細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌（酵母菌）菌落數(shù)第一次測(cè)定結(jié)果超出該品種項(xiàng)下要求時(shí)，應(yīng)從同一批號(hào)樣品中隨機(jī)抽樣，復(fù)試2次，以3次結(jié)果平均值匯報(bào)。（三）眼科用藥霉菌和酵母菌菌落數(shù)復(fù)試匯報(bào)，須以2次復(fù)試結(jié)果均不得長(zhǎng)菌，方可判供試品合格。微生物限度檢查法第52頁(yè)（四）如營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板生長(zhǎng)霉菌（酵母菌）菌落數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)細(xì)菌菌落數(shù)超出該品種項(xiàng)下微生物程度要求時(shí)，經(jīng)復(fù)試2次，如3次結(jié)果平均值仍超出要求，應(yīng)判供試品不合格。（五）各類制劑檢出控制菌或其它致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)試，即應(yīng)判該供試品不符合要求。微生物限度檢查法第53頁(yè)沙

門

菌

檢

驗(yàn)

程

序微生物限度檢查法第54頁(yè)銅

綠

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序微生物限度檢查法第55頁(yè)金

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葡

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菌

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驗(yàn)

程

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微生物限度檢查法第56頁(yè)破

傷

風(fēng)

梭

菌

檢

驗(yàn)

程

序微生物限度檢查法第57頁(yè)無(wú)

菌

室

技

術(shù)

要

求微生物程度及無(wú)菌檢驗(yàn)試驗(yàn)室條件應(yīng)滿足工作任務(wù)要求，有完善試驗(yàn)設(shè)施和管理制度。在未普遍采取當(dāng)代化無(wú)菌隔離器技術(shù)之前，無(wú)菌試驗(yàn)室仍是最慣用無(wú)菌環(huán)境之一。1.

無(wú)菌室建筑設(shè)計(jì)應(yīng)充分考慮其合理布局，使用方便，操作安全等條件。應(yīng)設(shè)在較潔凈環(huán)境內(nèi)。遠(yuǎn)離交通干道、廁所及污染區(qū)，最好在二樓以上，應(yīng)選上下水道及其它安裝適宜位置。2.專用無(wú)菌室無(wú)菌檢驗(yàn)、微生物程度檢驗(yàn)與抗生素微生物檢定用試驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格分開(kāi)，具危險(xiǎn)性毒菌、毒素如破傷風(fēng)梭菌、黃曲霉素需單獨(dú)使用，方便控制、預(yù)防傳輸。微生物限度檢查法第58頁(yè)3、

無(wú)菌室操作間面積不超出10m2、高不超出