細(xì)胞培養(yǎng)無菌技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)無菌技術(shù)第1頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六無菌操作技術(shù)的意義體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致污染。因而，為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。第2頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】

在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。第3頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【洗手和著裝】

原則上和外科手術(shù)相同。在利用超凈臺工作時，應(yīng)徹底洗手，要戴口罩、著消毒衣帽，并于開始操作前用75%酒精消毒手套。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手，換新的口罩、消毒衣帽。第4頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六手套的正確帶法第5頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六手套的正確帶法第6頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六手套的正確帶法第7頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【操作野消毒】

超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線。消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。第8頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【器皿消毒】

需要的器皿均應(yīng)在使用前放入超凈臺紫外滅菌。所有用到的器皿（買時已滅菌的除外）都必須經(jīng)過高壓滅菌烘干后，才能放入超凈臺內(nèi)。已滅菌的、外包裝完好的培養(yǎng)瓶、離心管、凍存管等可以表面經(jīng)過75%酒精擦拭后直接放入超凈臺。第9頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【操作注意事項】手消毒與燒灼雙手戴手套后，必須經(jīng)過75%酒精全面消毒才能接觸超凈臺和培養(yǎng)箱。雙手接觸外部物件后均應(yīng)重新消毒。超凈臺經(jīng)過30min紫外滅菌后，才能打開通風(fēng)裝置。開始工作的第一步就是點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。燒灼的時間保持適當(dāng)?shù)拈L度，如果是玻璃器皿可以稍長一點，如果是塑料器皿，也應(yīng)保持5s以上，同時要保證燒灼是全方位的。比如，360度旋轉(zhuǎn)瓶口、從吸管的末端開始等。必要時，可以反復(fù)重復(fù)燒灼。第10頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【操作注意事項】動作與擺放進(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿的內(nèi)部，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。各類物件的擺放應(yīng)適合人體功能學(xué)，保證拿取的方便快捷，操作的流暢。第11頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【操作注意事項】瓶口的擺放培養(yǎng)瓶打開后，應(yīng)平放在臺面上，瓶口保持斜向上。打開的培養(yǎng)液瓶口也應(yīng)保持適度傾斜放置，避免瓶口垂直放置。在具體操作過程中，也應(yīng)注意所有的瓶口保持傾斜。第12頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【操作注意事項】瓶蓋及吸液培養(yǎng)細(xì)胞較多時，打開的培養(yǎng)瓶蓋子應(yīng)按照一定順序排放，保證瓶子之間的蓋子不亂蓋。吸液操作時應(yīng)注意更換不同的吸管，防止交叉感染。吸液時，動作輕柔，盡量避免吸管碰到瓶口。吸管內(nèi)有液體時，應(yīng)保持管頭比管尾低，防止內(nèi)部液體倒流至尾部。第13頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【操作注意事項】培養(yǎng)瓶的拿取從培養(yǎng)箱內(nèi)取培養(yǎng)瓶時，先將蓋子擰緊，再拿出。并且保持瓶口向上。做鏡下觀察時，保持蓋子是擰緊的狀態(tài)。操作結(jié)束后，培養(yǎng)瓶先擰緊瓶蓋，經(jīng)75%酒精擦拭后，放入培養(yǎng)箱，在培養(yǎng)箱里將培養(yǎng)瓶蓋子旋松。培養(yǎng)液瓶、胰酶瓶等的蓋子只有在要取液時方能打開，取完后立即燒灼旋緊。比如為兩個培養(yǎng)瓶加液時，在為第一個加液后，就應(yīng)立即蓋上蓋子，再用再打開，防止瓶口敞開的時間過長。第14頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【操作注意事項】封口膜封口膜應(yīng)在超凈臺開紫外前剪好，75%酒精擦拭后置于超凈臺內(nèi)紫外滅菌。封口膜的寬度在1cm左右，長度因瓶口的粗細(xì)有不同，但均應(yīng)保證其旋轉(zhuǎn)的周數(shù)在2周以上。封口膜在封口時，拉的力度要適中，不能拉斷，也不能纏的過松，保證封口的效果。第15頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【操作注意事項】結(jié)束后消毒實驗結(jié)束后，規(guī)范熄滅酒精燈，即：先蓋上燈蓋，待火焰熄滅后，拿起燈蓋晃動兩下再重新蓋上。實驗結(jié)束后，用75%酒精棉球擦拭超凈臺內(nèi)部，操作區(qū)域最少擦拭3次。超凈臺外部，操作口處用75%酒精棉球擦拭。培養(yǎng)箱的外門和內(nèi)部玻璃門用75%酒精棉球擦拭。第16頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六【操作注意事項】房間消毒消毒結(jié)束后，拉下超凈臺玻璃門，打開超凈臺紫外，消毒30min。無菌培養(yǎng)室用完后用消毒水拖