細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死第1頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞凋亡（科普詩）似秋葉的凋零，告別生命之輝煌；那難以計(jì)數(shù)的攻擊、誘導(dǎo)，輕啟著道道程序，逼細(xì)胞步步走向生命的末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點(diǎn)一點(diǎn)擰淡;第2頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞凋亡（科普詩）似秋葉的凋零，告別生命之輝煌；那難以計(jì)數(shù)的攻擊、誘導(dǎo)，輕啟著道道程序，逼細(xì)胞步步走向生命的末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點(diǎn)一點(diǎn)擰淡;第3頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六危難中的細(xì)胞啊，你沉穩(wěn)不亂，DNA片片切割，化云梯直通天堂；細(xì)胞體分團(tuán)相聚，把生命的凝重濃集在小體上；分別了朝夕相處的伙伴，再見了快樂美好的時(shí)光；這一切的一切又融入臨近的胞體，騰出的空間再寫生命的篇章。

第4頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞死亡形式1.細(xì)胞壞死由于比較強(qiáng)烈的有害刺激或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的嚴(yán)重紊亂而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。2.細(xì)胞凋亡由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程稱為細(xì)胞凋亡（apoptosis),又稱程序性細(xì)胞死亡（programmedcelldeath,PCD)。第5頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六第6頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六

壞死凋亡1.性質(zhì)病理性,非特異性生理性或病理性，特異性2.誘導(dǎo)因素強(qiáng)烈病理性刺激,隨機(jī)發(fā)生生理性或較弱病理性刺激,非隨機(jī)發(fā)生3.生化特點(diǎn)被動(dòng)過程,無新蛋白合成,不耗能耗能的主動(dòng)過程，有新蛋白合成4.形態(tài)變化細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細(xì)胞腫脹胞膜及細(xì)胞器相對(duì)完整細(xì)胞皺縮，核固縮,膜可發(fā)泡成芽,形成凋亡小體5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-120bp）,電泳呈“梯”狀條帶6.炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對(duì)完整，局部無炎癥反應(yīng)7.凋亡小體無有8.基因調(diào)控?zé)o有細(xì)胞凋亡與壞死的比較第7頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞凋亡的生理和病理意義1.確保正常發(fā)育、生長:指趾間隙形成；2.維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定:組織細(xì)胞更新(上皮組織/血細(xì)胞/衰老細(xì)胞)、生理器官內(nèi)分泌調(diào)控（子宮產(chǎn)后復(fù)員/月經(jīng)期子宮內(nèi)膜脫落）、受損不能修復(fù)細(xì)胞或突變細(xì)胞清除；3.發(fā)揮積極的防御功能：病原微生物的宿主細(xì)胞發(fā)生主動(dòng)凋亡。第8頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞凋亡與疾病發(fā)生機(jī)制的新認(rèn)識(shí)1.該“死”的細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞、自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞）未死，是造成腫瘤、自身免疫性疾病的主要發(fā)病機(jī)制之一。——細(xì)胞凋亡不足2.不該“死”的細(xì)胞（如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞）死了，這與老年性癡呆、心肌缺血/再灌注損傷等發(fā)病有關(guān)?！?xì)胞凋亡過度第9頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞凋亡的過程1.凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)2.凋亡基因激活3.細(xì)胞凋亡的執(zhí)行4.凋亡細(xì)胞的清除第10頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六凋亡過程及分期

誘導(dǎo)期執(zhí)行期消亡期

凋亡誘導(dǎo)因素受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺死亡信號(hào)凋亡相關(guān)基因激活Dnase激活Capases激活巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞凋亡細(xì)胞第11頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六凋亡時(shí)細(xì)胞的主要變化一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變1.細(xì)胞膜的變化：微絨毛、細(xì)胞突起和細(xì)胞表面皺褶消失；胞膜空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不斷擴(kuò)張并與胞膜融合形成芽狀突起（出芽）；2.細(xì)胞質(zhì)變化：胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞器變化（線粒體變大脊增多可空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大提供包裹膜）；3.細(xì)胞核變化：核內(nèi)染色質(zhì)濃縮邊集空泡化、固縮、出芽、邊集、凋亡小體（apoposisboby）第12頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六最早期形態(tài)學(xué)改變是細(xì)胞間的間接丟失與鄰近細(xì)胞脫離并失去微絨毛胞漿濃縮及核質(zhì)密度增高（DNA斷裂）凋亡小體識(shí)別、吞噬（無炎癥反應(yīng)）第13頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六

典型的凋亡小體（apoposisboby）：由透亮空泡和不透光的濃密的核碎片兩部分組成。第14頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六胸腺細(xì)胞正常凋亡第15頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六胸腺細(xì)胞正常凋亡第16頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞凋亡的生化改變1.DNA的片段化“梯”狀條帶2.內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用3.凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用第17頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六1.DNA的片段化“梯”狀條帶為細(xì)胞凋亡主要特征①幾乎所有凋亡細(xì)胞均有核小體間的裂解，導(dǎo)致DNA的斷裂；②DNA降解過程的特異性：不伴有組蛋白和其它核蛋白的降解；③染色質(zhì)在核小體間的裂解是凋亡細(xì)胞和形態(tài)改變的基礎(chǔ)；④DNA片段化是凋亡的“黃金標(biāo)記”。第18頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六第19頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六2.內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用由一系列胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié)激活，執(zhí)行染色質(zhì)DNA切割第20頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六3.Caspase9激活，需要通過CARD（caspase-recruitmentdomain)、Apaf-1、細(xì)胞色素c、ATP等多個(gè)因子的參與1.滅活細(xì)胞凋亡的抑制物（如Bcl-2）；2.水解細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞解體，形成凋亡小體（apoposisboby）；3.在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中水解相關(guān)活性蛋白，使該蛋白獲得或喪失某種生物學(xué)功能Caspases在凋亡中的主要作用第21頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞凋亡的調(diào)控（一）細(xì)胞凋亡相關(guān)因素

1.誘導(dǎo)性因素

2.抑制性因素

(二)細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)第22頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六1.細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素.生理活性因子：TNF家族（Fas-L,TNF)、TGF、神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸、多巴胺)、生長因子撤退、GC等.損傷相關(guān)因子：熱休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射線等.化療藥物.毒素：乙醇、β-淀粉樣肽第23頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六2.細(xì)胞凋亡的抑制因素.凋亡相關(guān)基因的抑制作用：p53、bcl-2、bcl-XL等。.生理性抑制劑：生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)、鋅、雄激素、雌激素等.病毒基因：腺病毒E1B、桿狀病毒p35、棒狀病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBVBHRF1等.藥物：Calpain抑制劑、caspases抑制劑、促癌劑、佛波豆蔻乙脂(PMA)等第24頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六(二)細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)

-凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)特點(diǎn)①多樣性：不同種類的細(xì)胞系統(tǒng)不同②偶聯(lián)性：與增殖分化的信號(hào)系統(tǒng)交叉偶聯(lián)③同一性：多因素，共用同一系統(tǒng)觸發(fā)④多途性：同一誘導(dǎo)因素啟動(dòng)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑第25頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六㈡細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)信號(hào)cellR神經(jīng)酰胺多途徑RSAPK/JNKP53基因NF-kB,JNK/AP-1途徑激活baxor下調(diào)bcl-2ROSmtDNA第26頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六㈢細(xì)胞凋亡相關(guān)基因抑制凋亡基因：bcl-2促進(jìn)凋亡基因：fas，P53雙向調(diào)控基因：c-myc，bclx第27頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六Bcl-2抗凋亡機(jī)制①直接的抗氧化②抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì)③抑制促凋亡的Bax，Bak細(xì)胞毒作用④抑制Caspases激活⑤維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)第28頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制（一）氧化損傷（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡

(三)線粒體損傷第29頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六（一）氧化損傷機(jī)制氧自由基可破壞機(jī)體正常的氧化/還原的動(dòng)態(tài)平衡，造成生物大分子的氧化損傷，干擾正常的生命活動(dòng)，形成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)——后果：誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。第30頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細(xì)

胞凋亡的可能機(jī)制1.激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶(DNase)，降解DNA鏈；2.激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細(xì)胞內(nèi)肽鏈間的酰基轉(zhuǎn)移，在肽鏈間形成共價(jià)鍵，使細(xì)胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成；3.激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；4.Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈?zhǔn)嬲?，暴露出核小體之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點(diǎn)，有利于DNA內(nèi)切酶切割DNA。第31頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義1.發(fā)育從低等動(dòng)物到高等動(dòng)物的發(fā)育，都存在著程序性細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。2.免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞發(fā)育分化成熟過程中，始終伴隨著細(xì)胞凋亡。3.衰老細(xì)胞凋亡與許多年齡相關(guān)疾病有直接或間接的聯(lián)系。4.損傷與修復(fù)5.腫瘤發(fā)生細(xì)胞增殖與死亡的速度平衡失調(diào)。6.病毒致病病毒表達(dá)抗凋亡蛋白。第32頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六第33頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞凋亡的檢測(cè)隨著研究技術(shù)的提高和對(duì)凋亡的認(rèn)識(shí)不斷深入，檢測(cè)凋亡的方法已從細(xì)胞、染色質(zhì)到分子水平日趨完善和成熟。1.形態(tài)學(xué)檢測(cè)2.DNA降解分析3.凋亡酶學(xué)分析4.凋亡相關(guān)蛋白分析5.流式細(xì)胞分析第34頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六一．細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)分析細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化主要表現(xiàn)為：細(xì)胞皺縮(cellshrinkage)，失去細(xì)胞連接(celljunction)，微絨毛(microvilli)消失，發(fā)泡(blebbing)，染色質(zhì)濃集并靠近核膜，形成沿核膜收縮的新月狀體(crescents)，形成凋亡小體(apoptoticbody)等。第35頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)方法可鑒定凋亡細(xì)胞特征光學(xué)顯微鏡相差顯微鏡透射電鏡

聚焦激光掃描電鏡掃描電鏡流式細(xì)胞儀縮時(shí)攝影術(shù)細(xì)胞體積縮小、核濃縮、細(xì)胞周圍透明圈細(xì)胞發(fā)泡、凋亡小體微絨毛消失、染色質(zhì)沿核膜分布、新月體狀核、凋亡小體凋亡細(xì)胞內(nèi)固縮染色質(zhì)及核碎片定位細(xì)胞膜表面泡狀鼓起低前向散射光(FSC)、高側(cè)向散射光(SSC)凋亡細(xì)胞的形成過程第36頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六二.DNA降解分析DNA降解過程的特點(diǎn)：1.發(fā)生于凋亡早期，由內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活引起2.DNA在核小體連接部位斷裂，產(chǎn)生180－200bp為最小單位的單體或寡聚體片斷3.DNA碎片可被細(xì)胞膜包裹，形成凋亡小體第37頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六

(一)DNA凝膠電泳原理：凋亡細(xì)胞降解產(chǎn)生一系列規(guī)則的DNA片斷，其電泳結(jié)果呈典型的“梯狀帶”(ladder)；而壞死或凋亡后壞死細(xì)胞的DNA分解是隨機(jī)的，產(chǎn)生的碎片分子量大小不一，在電泳時(shí)形成“涂片狀”(smear)。普通瓊脂糖凝膠電泳、Southernblotting、放射自顯影(32PdATP或32PdCTP連接到DNA片斷的3’端)第38頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六(二)原位標(biāo)記法TUNEL(TdTmediateddUTPnick

endlabeling)終末脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)。原理：在TdT的作用下，帶有標(biāo)記物的dUTP被連接在斷裂DNA3’末端，然后通過相應(yīng)的方法檢測(cè)標(biāo)記物，從而判斷是否有凋亡發(fā)生。應(yīng)用范圍：石蠟包埋的組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)細(xì)胞、組織中分離的細(xì)胞 第39頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六(三)ELISA法

原理：以抗組蛋白抗體包被微孔板壁，加入標(biāo)本，凋亡細(xì)胞的核小體可與抗體結(jié)合，再加入抗-DNA片斷-POD復(fù)合物，與核小體中的DNA片斷結(jié)合，最后加入POD顯色底物，以酶標(biāo)儀測(cè)定光密度以進(jìn)行定量分析。第40頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六三.凋亡酶學(xué)分析1.內(nèi)切核酸酶(endonuclease,DNase)

種類：DNaseⅠ（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體),DNaseⅡ（溶酶體、胞核)，NUC18（胞核，胸腺細(xì)胞中)等

作用：使DNA斷裂成180－200bp或其倍數(shù)的片斷

激活機(jī)制：CAD(caspase-activateDNase)ICAD(inhibtorofCAD)

檢測(cè)：WesternBlotting第41頁，共45頁，2023年，2月20日，星期六Caspases的檢測(cè)

1.Caspase-3活性測(cè)定(FIENA法)

熒光測(cè)定免疫吸附法(flurometricimmunosorbentenzymeassay,FIENA),casp