細菌藥敏試驗及其耐藥表型檢測

細菌藥敏試驗及其耐藥表型檢測第1頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六抗菌藥物敏感試驗測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑菌或殺菌作用的方法稱為抗菌藥物敏感性試驗（AntimicrobialSusceptibilityTest），簡稱藥敏試驗（AST）。第2頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六藥敏試驗的意義預測抗菌治療的效果；指導抗菌藥物的臨床應用；發(fā)現(xiàn)或提示細菌耐藥機制的存在，能幫助臨床醫(yī)生選擇合適的藥物，避免產(chǎn)生或加重細菌的耐藥；監(jiān)測細菌耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染的流行病學，以控制和預防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。第3頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六藥敏試驗MIC：在與微生物生長速率有關的特定時間間隔內(nèi)，通常是18～24小時，能夠抑制被測菌生長的最低藥物濃度。第4頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六敏感性分類(CLSI的定義)敏感（Susceptible）用常規(guī)用量治療有效常規(guī)用藥時達到的平均血藥濃度超過細菌的MIC5倍以上。耐藥（Resistance）用常規(guī)用量治療不能抑制細菌的生長MIC高于藥物在血、體液中可能達到的濃度第5頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六敏感性分類（2）中介(Intermediate)MIC接近血、體液中藥物的濃度，治療反應率低于敏感株藥物生理濃集部位有效(尿-FQ)加大用藥劑量可能有效第6頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六藥敏試驗的方法學半定量…紙片擴散法(抑菌圈直徑)MIC法：稀釋法(肉湯、瓊脂)自動化儀法抗生素連續(xù)梯度法(Etest)流式細胞儀第7頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六

將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關關系。紙片擴散法（Kirby-Bauer法）第8頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六紙片擴散法水解酪蛋白（MH）培養(yǎng)基，pH7.2～7.4，做成瓊脂厚度4mm，直徑90mm的平板；挑取孵育16～24小時已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥氏標準。

第9頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六紙片擴散法用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉擠去多余菌液；然后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉平板60度；最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；平板在室溫下干燥3～5min，用無菌鑷子或商品化的紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心距離應大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣大于15mm。第10頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六紙片擴散法35℃孵育16～24小時量取抑菌圈直徑；根據(jù)抑菌環(huán)的直徑，按照CLSI標準判讀，報告敏感、中介、耐藥。第11頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六紙片擴散法－影響因素MIC接種菌量細菌生長率抗生素含量、擴散性平皿厚度溫度，預孵育時間12第12頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六紙片擴散法－標準化CLSI：美國實驗室標準化委員會(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute)每年修訂更改包括質(zhì)控新藥的判定標準特殊耐藥性的檢測13第13頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六CLSI的法規(guī)規(guī)定紙片含量、接種濃度、培養(yǎng)基、平皿厚度、判定標準、質(zhì)控；規(guī)定常規(guī)測試報告的抗生素；不同的藥判定標準不同；不同的菌判定標準也不同。14第14頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六常規(guī)測試并報告的藥物分組(1)

腸桿菌科

綠膿和非腸桿菌科一級氨芐西林頭孢他啶，慶大霉素頭孢唑林，慶大霉素 替卡西林，哌拉西林二級阿米卡星 阿米卡星氨芐西林/舒巴坦頭孢吡肟，頭孢哌酮

阿莫西林/克拉維酸 氨曲南頭孢呋肟，頭霉素 環(huán)丙沙星，亞胺培南頭孢噻肟，頭孢曲松替卡西林/克拉維酸

環(huán)丙沙星，亞胺培南妥布霉素，復方磺胺

替卡西林，哌拉西林 三級氨曲南，頭孢他啶 頭孢曲松卡那霉素，奈替米星氯霉素，奈替米星妥布霉素 四環(huán)素，氯霉素

15第15頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六常規(guī)測試并報告的藥物分組(2)

葡萄球菌

腸球菌一級苯唑西林，青霉素青霉素，氨芐西林二級紅霉素類 萬古霉素克林霉素，萬古霉素三級氯霉素 慶大霉素16第16頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六常規(guī)測試并報告的藥物分組(3)

流感嗜血桿菌

肺炎鏈球菌一級氨芐西林，青霉素 青霉素，紅霉素復方磺胺

復方磺胺二級頭孢呋肟，頭孢噻肟 氧氟沙星，四環(huán)素頭孢他啶，氯霉素萬古霉素三級阿奇霉素，頭孢克羅 氯霉素，利福平環(huán)丙沙星，亞胺培南 利福平，四環(huán)素17第17頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六預報用藥(一)

測試藥 菌名 推測其他藥物的敏感性苯唑西林 葡萄球菌 所有β-內(nèi)酰胺類四環(huán)素 所有（除葡 多西環(huán)素，米諾環(huán)素

萄球菌和不 動桿菌〕紅霉素 G＋球菌 羅紅霉素，克拉霉素，

阿奇霉素克林霉素 所有 林可霉素18第18頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六預報用藥(二)測試藥 菌名 推測其他藥物的敏感性氨芐西林 腸球菌 青霉素青霉素G 葡萄球菌 氨芐西林，美洛西林

替卡西林頭孢噻吩 腸桿菌科 頭孢拉定，頭孢氨芐

頭孢克羅奈啶酸

腸桿菌科 所有氟喹諾酮類萬古霉素

所有 替考拉寧4/23/202319第19頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六以一定濃度的抗菌藥物與含有被試菌株的培養(yǎng)基進行一系列不同倍數(shù)稀釋（通常為雙倍稀釋），經(jīng)培養(yǎng)后觀察其最低抑菌濃度。稀釋法中用瓊脂培養(yǎng)基者為瓊脂稀釋法，用肉湯培養(yǎng)基者為肉湯稀釋法。藥敏試驗-稀釋法第20頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六Etest法E試條是一條5mm×50mm的無孔試劑載體，一面固定有一系列預先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗菌藥物，另一面有讀數(shù)和判別的刻度；抗菌藥物的梯度可覆蓋有20個MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍；將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細菌的最小抑菌濃度。第21頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六2023/4/23wanghui-ART22Etest法

細菌生長區(qū)Etest塑料條橢圓形細菌生長抑制區(qū)2561288016判讀抑菌濃度（MICug/ml)第22頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六Etest法菌液制備及接種均同紙片擴散法。90mm平板上可放E試驗試條1～2條，140mm平板最多可放6條。孵育溫度及時間同紙片擴散法。第23頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六Etest法優(yōu)點連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關性好影響因素少，穩(wěn)定性高操作簡單，省時缺點：昂貴用途：快生長菌，苛養(yǎng)菌，厭氧菌，酵母菌，分枝桿菌4/23/202324第24頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六細菌耐藥機制

細菌耐藥機制主要有四種：產(chǎn)生一種或多種水解酶、鈍化酶和修飾酶；抗生素作用的靶位改變，包括青霉素結合蛋白位點、DNA解旋酶、DNA拓撲異構酶Ⅳ的改變等；細菌膜的通透性下降，包括細菌生物被膜的形成和通道蛋白丟失；細菌主動外排系統(tǒng)的過度表達。在上述耐藥機制中，第一、二種耐藥機制具有專一性，第三、四種耐藥機制不具有專一性。第25頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六Β-內(nèi)酰胺酶

β內(nèi)酰胺酶是一類水解青霉素、頭孢菌素類抗生素的滅活酶；該酶位于革蘭陽性球菌菌體外，革蘭陰性桿菌間質(zhì)中；檢測方法有微生物培養(yǎng)法、碘－淀粉法、頭孢硝噻吩紙片法。其中頭孢硝噻吩紙片法因為簡單、方便、快速，應用于臨床檢測。第26頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六

葡萄球菌屬–青霉素

方法敏感中介耐藥MIC0.12g/ml-0.25g/ml紙片擴散法29mm-28mmCLSIM100-S20.Table2C.第27頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六誘導β-內(nèi)酰胺酶試驗苯唑西林(誘導劑)接種純菌落于瓊脂上(例如，BAP,MHA)；貼?-內(nèi)酰胺類紙片(例如,苯唑西林,頭孢西丁)；孵育過夜；測試抑菌圈周圍的細菌；如果β-內(nèi)酰胺酶陽性,報告青霉素R。PosNeg第28頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）ESBLs是指由質(zhì)粒介導的能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)內(nèi)酰胺類氨曲南的一類酶；ESBLs不能水解頭霉素類和碳青霉烯類藥物，能被克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦等內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制；ESBLs主要見于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也見于腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、沙雷菌屬等其他腸桿菌科細菌、不動桿菌、銅綠假單胞菌。第29頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）紙片法，出現(xiàn)以下一種情況即可懷疑該菌株產(chǎn)生ESBL（篩選陽性）：頭孢泊肟≤17mm頭孢他啶≤22mm頭孢噻肟≤27mm頭孢曲松≤25mm氨曲南≤27mm第30頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）紙片法（表型確認試驗）頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任一復方制劑的抑菌圈直徑與相應單藥抑菌圈直徑相差≥5mm時，即可判斷該菌產(chǎn)ESBL。第31頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）稀釋法，出現(xiàn)以下一種情況即可懷疑該菌株產(chǎn)生ESBL：頭孢他啶或頭孢噻肟或頭孢曲松或氨曲南MIC≥2mg/mL或頭孢泊肟MIC≥8mg/mL

第32頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）稀釋法（表型確認試驗）頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任何一組酶抑制劑復方制劑的MIC值比相應單藥的MIC降低3個稀釋度者即可判定該菌為產(chǎn)ESBL菌株。

第33頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六AmpC酶的特征AmpC酶是在革蘭陰性菌中發(fā)現(xiàn)的由染色體或質(zhì)粒介導的水解頭孢菌素的Ⅰ型β內(nèi)酰胺酶，可分為誘導酶和非誘導酶。與ESBLs不同的是，AmpC酶對三代頭孢菌素耐藥但對四代頭孢菌素敏感且不被酶抑制劑克拉維酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。第34頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六AmpC酶的檢測方法頭孢西丁三維試驗是檢測AmpC酶的經(jīng)典方法；除此之外，還有以硼酸化合物為抑制劑檢測肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的AmpC酶、AmpCDisk、頭孢西丁瓊脂基礎法等。第35頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定義為具有水解碳青霉烯類抗生素活性的β-內(nèi)酰胺酶，主要分布于β-內(nèi)酰胺酶A、B、D類中。根據(jù)水解機制中作用位點的不同可以將碳青霉烯酶分為兩大類：一類稱為金屬碳青霉烯酶，這類酶以金屬鋅離子為活性作用位點，可以被EDTA抑制，屬于B類β-內(nèi)酰胺酶；另一類以絲氨酸（Ser）為酶的活性作用位點，可以被酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦所抑制，屬于A、D類β-內(nèi)酰胺酶。第36頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六碳青霉烯酶A類酶B類酶D類酶染色體編碼：SMENMCIMI質(zhì)粒編碼：KPCGES質(zhì)粒編碼OXA-23OXA-24OXA-51OXA-58OXA-55OXA-48OXA-50OXA-60OXA-62金屬酶，位于GMEs上，包括VIM，IMP，GIM，SPM，SIM等可以被酶抑制劑抑制可以被EDTA抑制第37頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六碳青霉烯酶表型檢測方法-改良hodge試驗ATCC25922，0.5麥氏，1:10稀釋涂MH平板平皿中心貼10μg

厄他培南或亞胺培南紙片10μl環(huán)挑取3～5個菌落從平板中心紙片邊緣向平板邊緣劃線被測菌株與大腸埃希菌ATCC25922抑菌環(huán)交匯處大腸埃希菌生長增強，即產(chǎn)碳青霉烯酶。第38頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六改良hodge試驗的結果判讀第39頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六金屬酶表型檢測方法：EDTA協(xié)同試驗用0.5麥氏單位的待測菌懸液涂布MH平板。貼IMP(10μg)紙片．距其1cm處貼EDTA紙片（0.5mol/L4μl）。35℃過夜培養(yǎng)。亞胺培南抑菌圈在靠近加EDTA紙片側明顯擴大者為產(chǎn)金屬酶菌株。

亞胺培南EDTA10mm第40頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）攜帶SCCmec基因盒。SCCmec基因盒中的MecA基因編碼修飾的青霉素結合蛋白PBP2a，這種蛋白對甲氧西林和其他的β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力下降，從而導致對這些抗生素的耐藥。耐甲氧西林葡萄球菌第41頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六耐甲氧西林葡萄球菌的檢測MRSA的檢測方法有頭孢西丁紙片擴散法、苯唑西林瓊脂稀釋法、乳膠凝膠試驗檢測PBP2a、mecA基因測定及MRSA顯色培養(yǎng)基。頭孢西丁紙片法、苯唑西林瓊脂稀釋法是目前檢測耐甲氧西林葡萄球菌最常用篩選方法。對于金黃色葡萄球菌，MRSA的檢測可以使用苯唑西林紙片，但對于凝固酶陰性葡萄球菌則不能使用苯唑西林紙片。

第42頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六凝固酶陰性葡萄球菌中苯唑西林MIC結果的報告策略*苯唑西林MIC(μg/ml)進行mecA或PBP2a或頭孢西丁紙片擴散≤0.25≥4.00.5-2.0報告苯唑西林敏感報告苯唑西林耐藥陰性陽性報告苯唑西林敏感報告苯唑西林耐藥*檢測無菌部位感染的非表皮葡萄球菌菌株第43頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六克林霉素誘導耐藥試驗第44頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六克林霉素誘導耐藥葡萄球菌紅霉素*耐藥的金葡菌或凝固酶陰性葡萄球菌可對克林霉素結構性或誘導性耐藥或僅對紅霉素耐藥。

*或其他大環(huán)內(nèi)酯類第45頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六機制耐藥基因紅霉素克林霉素核糖體修飾-藥物不能結合于靶位ermRS*RR結構性泵-藥物被泵出msrARSerm =erythromycinribosomemethylasemsrA =macrolidestreptograminresistance*需要誘導來顯示耐藥性

紅霉素/克林霉素耐藥葡萄球菌耐藥機制第46頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六誘導性克林霉素耐藥（erm介導）葡萄球菌-“D試驗”患者不會對克林霉素有反應-報告克林霉素耐藥無克林霉素誘導（msrA介導）真的克林霉素敏感-報告克林霉素敏感“D”陽性陰性15～26mm第47頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六葡萄球菌誘導性克林霉素耐藥的MIC檢測方法4.0 μg/ml紅霉素0.5 μg/ml克林霉素Nogrowth=無誘導性克林霉素耐藥生長=誘導性克林霉素耐藥第48頁，共54頁，2023年，2月20日，星期六對于紅霉素耐藥，克林霉素敏感的葡萄球菌，需檢測誘導性克林霉素耐藥注意試驗適用于金葡菌和凝固酶陰性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐藥株)；對于CoNS，該試驗不必常規(guī)開展因為克林霉素很少用于治療凝固酶陰性葡萄球菌；大多數(shù)醫(yī)院相關MRSA是克林霉素耐藥的；大多數(shù)社區(qū)相關MR