基因工程重組人干擾素概述

根據(jù)來源、基因序列和氨基酸組成分類

I型干擾素：ＩFNα、IＦNβ、ＩFNτ、IFＮω來源：白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、病毒感染的組織細(xì)胞等功能：抗病毒感染、抗腫瘤生長

免疫調(diào)節(jié)〔較弱)

其中IＦN-α為多基因產(chǎn)物,有２３種以上的亞型。ＩI型干擾素：干擾素γ(ＩFN)來源：活化的Ｔ細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生功能：免疫調(diào)節(jié)提高單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的抗原提呈能力增強(qiáng)Tc細(xì)胞和ＮK細(xì)胞的殺傷活性抑制TH２細(xì)胞形成,下調(diào)體液免疫應(yīng)答趨化作用抗病毒和抗腫瘤作用〔次要)２.根據(jù)動物來源確定分類,例如人干擾素〔HｕIFN)，小鼠干擾素(MuＩFN)。免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對宿主免疫細(xì)胞活性的影響,如對巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、Ｂ細(xì)胞和NK細(xì)胞等均有一定作用。對巨噬細(xì)胞的作用：IＦＮγ可使巨噬細(xì)胞外表ＭHCⅡ類分子的表達(dá)增加,增強(qiáng)其抗原遞呈能力；此外還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞外表表達(dá)Fc受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體和腫瘤細(xì)胞。對淋巴細(xì)胞的作用：干擾素對淋巴細(xì)胞的作用較為復(fù)雜，可受劑量和時間等因素的影響而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或?qū)⒏蓴_素與抗原同時投入會產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后參加干擾素那么能產(chǎn)生免疫增強(qiáng)的效果。在適宜的條件下，IFNγ對B細(xì)胞和CD８+T細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用,但不能促進(jìn)其增殖。ＩＦNγ能增強(qiáng)ＴH１細(xì)胞的活性,增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能；但對TH２細(xì)胞的增殖有抑制作用,因此抑制體液免疫功能。IFNγ不僅抑制TH２細(xì)胞產(chǎn)生IL－４,而且抑制IL-４對Ｂ細(xì)胞的作用,特別是抑制B細(xì)胞生成IgＥ。對其它細(xì)胞的作用：IFＮγ對其他細(xì)胞也有廣泛影響：①刺激中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力；②活化NK細(xì)胞,增強(qiáng)其細(xì)胞毒作用；③使某些正常不表達(dá)MＨCⅡ類分子的細(xì)胞〔如血管內(nèi)皮細(xì)胞、某些上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞)表達(dá)MHCⅡ類分子,發(fā)揮抗原遞呈作用；④使靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對中性粒細(xì)胞的粘附能力更強(qiáng)，且可分化為高內(nèi)皮靜脈,吸引循環(huán)的淋巴細(xì)胞。二重組干擾素的臨床應(yīng)用廣譜抗病毒活性(rｈuＩFNα〕慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性(rｈｕIＦNα〕毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性——治療慢性肉芽腫瘤〔ｒhuIＦNγ)多發(fā)性硬化癥rhuＩFNβ對基因序列的干擾素,基因文庫的調(diào)用可以用其序列３＇端和５'端局部事先用同位素?標(biāo)記過的序列作為探針，通過雜交的方法進(jìn)展調(diào)用。由于干擾素基因的種屬特異性不是很大,|可以用人的干擾素基因為同源探針,從鼠基因文庫中調(diào)出相應(yīng)的干擾素基因,其方法將在下文１中提到。｜

對于擾素基因的取用,不僅可以使用構(gòu)建基因文庫的方法，對已了解其氨基酸或核昔酸割

成的干擾素也可以用化學(xué)合成的方法先合成其編碼的DNA序列,再對其進(jìn)展表達(dá)?；瘜W(xué)合｜成方法包括固相合成法及液相合成法兩大類。與利用基因文庫的方法相比,化學(xué)合成法比較|復(fù)雜，由于每參加一個核昔酸就會有一定比例的錯誤摻入、基因重疊、基因缺失等情況,并且在ｌ整個合成過程中這種錯誤不斷積累，因此該方法適合比較短的基因,而對長的基因那么有目的產(chǎn)|物含量低、產(chǎn)物純化困難的缺點。但它也有優(yōu)點,如可根據(jù)研究的需要對一些氨基酸進(jìn)展定點|突變,或根據(jù)宿主菌的特性，在不改變其氨基酸組成的情況下使用宿主的偏愛密碼子,以提高|產(chǎn)物的產(chǎn)量。|?對于不同亞型的干擾素,由于同源性較高,可以用一樣的引物從誘導(dǎo)的小鼠細(xì)胞系中提取?mＲＮA混合物進(jìn)展反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增,然后用亞型特異性探針對CDNA混合物進(jìn)展Ｓoutheｒn印跡,這樣便可將序列上相差較小的同種、不同亞型的干擾素基因進(jìn)展別離,為生產(chǎn)高純度的單一干擾素提供了方法Ｏ?三、表達(dá)方法?隨著對干擾素研究的深入,人們了解到鼠干擾素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的

１０～４０位、７８～１０７位、１２３～１６６位的Ａ、B、C區(qū)，尤其是位于７８和７９位的氨基酸對抗病毒|活性十分重要。而人IFNt１的１２１～１３６位對抗病毒活性作用較大,人ＩFＮ子的N端１０個集|基酸也是保持其活性所必需的。對干擾素構(gòu)造的了解為更好地構(gòu)建基因表達(dá)奠定了根底。干|擾素最初是用其外源序列進(jìn)展表達(dá)的，但近年來的研究說明嵌合表達(dá)的干擾素往往優(yōu)于單一

干擾素,因此出現(xiàn)了較多的嵌合表達(dá)形式,并取得了較好的效果。?１.ＩFN-α的表達(dá)家蠶作為一種用于表達(dá)外源基因的宿主有易于養(yǎng)殖、生產(chǎn)周期短、夕陽基因表達(dá)量高的優(yōu)點,同時由于家蠶為真核生物,能對表達(dá)產(chǎn)物自行進(jìn)展糖基化修飾,產(chǎn)生有生物活性的蛋白，并且在產(chǎn)物提取的過程中只要將家蠶進(jìn)展勻漿,再進(jìn)展抽提即可，操作上十分方便，因此,它在基因工程領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用。下面便以人IＦN,α的生產(chǎn)為例介紹家蠶表達(dá)體系在干擾素生產(chǎn)中的應(yīng)用。

用家蠶核型多角病毒BIIＩNPV體外感染的家蠶傳代細(xì)胞株BＭ-N通過噬菌斑法純化得到BmNPＶ的τ３亞型。利用從感染脂肪體mRＮＡ制得的CDＮA為探針，對其多角蛋白序列進(jìn)展檢驗，其中１０．５ｋb的EcｏRＩ片段及３.９?fàn)N的ＨｉndE片段可與探針雜交,將１０.５燦的EcｏRI片段克隆到pＢR３２２中,產(chǎn)生質(zhì)粒pBｍE３６０對其用HｉndＥ切，得到３.９ｋb片段，其中|含有多角蛋白全部序列(圖１２３中為黑色框架),將該片段插入pＵC９的HinｄE位點,產(chǎn)生質(zhì)|粒p９H１８。將ｐ９H１８用EｃｏＲI切后于５０UＢAＬ３１外切核酸酶緩沖液中２３℃水?。保癿iｎ,更|掐鍾油油菲如ｎ入０７倍他烈的。氣mｎlAｄEDＴA終止反響。將截短的p９H１８片段用HindEi切,并通過瓊脂糖凝膠電泳別離２.７kｂ的Hｉnd皿平頭末端片段,將其插入pUC９即ｐ９B３１０?的HiｎｄHＩ-ＳｍaＩ位點O另外,將pBmE３６的３.１峙的HinｄE片段連接到ｐＵC８上，得到質(zhì)粒ｐ８H２２５，用EcｏRI及AatＥ切,得含有多角蛋白基因下游３.１kb基因的３．５kb片段,將其連接到p９H１８的４.７kb的ＥcoRIAaｔE片段上，產(chǎn)生雜交質(zhì)粒ｐ８９B３１０,它在啟動子下游含有多聚接頭〔EcｏＲI、BaｍＨＩＳｍaI、SalＩ、ＰstI位點〕。將從基因文庫中用１８３bp探針調(diào)出的在AＴG后含有SmaＩ位點〔即有序列ＣＣCＧＧGATＧ)的IFNｍαＪ基因片段連接到p８９B３１０上，便構(gòu)建成質(zhì)粒pIＦN２Ｂ３１０。將pＩFＮ２B３１０與病毒基因組DNＡ便可共轉(zhuǎn)染ＢM-N細(xì)胞系或家蠶幼體,其具體操作如下：向２．５mＬ含有０.２５mｏlACaＣl２、１０μgＢｍＮPVＤNA及６５μｇｐIFN２Ｂ３１０的溶液中加含０.２８II１０１４NaCl、０．７mｍoi/ＬＮａ２C０３、０．７IIIＩI１０１４Na２HP０４、５０mｍol/LEfＥPＥ(pH７.１〕的緩沖液，進(jìn)展沉淀。?。?４５mｌ沉淀加至４.５ｍi含３×１０６個細(xì)胞的培養(yǎng)液中,１２ｈ后換液一次，再培養(yǎng)４d,即可得到重組病毒ＢmIＦN２Ｂ３１０。用?兩個噬菌斑單位的病毒感染３×１０６個BM－N細(xì)胞或用５０μＬ３×１０５個噬菌斑單位的病毒溶液注人家蠶幼體,培養(yǎng)２４h后收集培養(yǎng)液便可得到干擾素。?２.IFN-目的表達(dá)將人IＦN-R基因HiｍdＥ片段插人載體ｐSV２-dｈfr中SＶ４０晚期啟動子PL下游的PｖuE位點。用此重組質(zhì)粒與帶有黃瞟嶺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XGＰRＴ)基因的質(zhì)粒pSU－-gｐt共轉(zhuǎn)染次黃瞟嶺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶〔HGＰRＴ)基因缺陷小鼠的骨髓瘤(sp２４)細(xì)胞Ｏ經(jīng)過霉盼酸及氨基喋嶺培養(yǎng)基篩選，便可得到表達(dá)人IFN-R。具體操作步驟如下：將含有人IFN-?p基因的重組質(zhì)粒ｐB(yǎng)V－９２用EcoRI及HｉndE酶切,分別作為探針模板及插入片段，同時用PvuII切載體pSVZdhfｒ質(zhì)粒,使其線性化后將外源基因插入。將次黃瞟嶺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因缺陷的sｐ２／０細(xì)胞在含有１０％小牛血清、１０%青鏈霉素的ＤLｆEM培養(yǎng)基中傳３～４代后在小空斑瓶中培養(yǎng)２４h,成半懸浮狀，４００r/勺１in離心５mｉn將細(xì)胞沉積參加新鮮培養(yǎng)基,再培養(yǎng)２～４h。轉(zhuǎn)染液中含目的基因pSVHIＦ和標(biāo)記基因pＳVZgpt(比值為１０：１),其中ＤNA濃度為２０μg/IＩIｌo在２ＩIIol/LCaCl２６３陣、１０mmolAＴｒis－HＣl(pH７．１)４２８μＬ中緩緩參加２×HeBs液(EEPES５０ｍmol只L、NaCl２８０ｍmｏlA、Na２ＨP０４０．７５mmolA、０．７５IIlII１０１４Na２ＨP０４,pH７.１)約５００μＬ,參加sｐ２/０細(xì)胞培養(yǎng)物中,輕輕搖勻３７℃孵育８h。再更換為含有黃瞟嶺２５０μg/mＬ、次黃瞟嶺１５μg/ｍL、胸昔１０μｇ/mL、氨基蝶嶺。－２μg／mＬ、霉盼酸２５問／mL的ＤｈEM培養(yǎng)基，３７℃cq孵箱中選擇性培養(yǎng)。一周后更換為含２５０μg/mL黃瞟嶺的D；舊M培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)２周以上,檢查IＦＮ－P活性。

３.ＩFN－γ的表達(dá)以鼠干擾素ＭｕＩFＮ-γ為例(圖１２-３)。用含人IＦN-γ編碼區(qū)基因的探針與噬菌體γMG９構(gòu)建的鼠Ｍ６００基因組DＮA文庫在２０%甲酷膠中進(jìn)展低嚴(yán)格性的雜交，膜用０．３molANaＣl、０．０３II１０１４擰棱酸納及０.１％NaEbS０４在室溫洗滌兩次。將結(jié)合的噬

菌體用噬菌斑法純化,提取DNA后,用多種限制性內(nèi)切酶切,以１%葡聚糖凝膠電泳純化后與人ＣDNＡ探針雜交,將γMG９中與探針可以雜交的１０.５kb的BaｍHI片段亞克隆到pＢR３２２的BaIIＩＨI位點,產(chǎn)生質(zhì)粒pMＧ１０.５。通過電泳分出插入片段大于６０００坤,即含有完整MuＩＦN-Y的質(zhì)粒,用PｖｕＩI酶切,六個切點中有一個位于５＇端非編碼區(qū),取從此切點到第一內(nèi)元中ClａI的３４８bp的片段以及用ClaI及BglH酶切得的ＭuＩFNmγ３F端片段Ｏ將載體質(zhì)粒ｐ３４２E用EcｏＲＩ及BamＨI酶切，并用聚合酶Ｉ將ＥcｏRI切點補(bǔ)成平頭末端,與以上制得的兩個片段混合，一同轉(zhuǎn)化大腸桿菌２９４,選出ＡＩIIP抗性菌株,從中提取質(zhì)粒即為含有干擾素編碼基因的ｐSＶEＩＩ１１１γ。用外表活性劑右旋糖所活化COEL１細(xì)胞,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入并培養(yǎng)４８ｈ后離心，上清液中便含有干擾素。

４．嵌合干擾素的表達(dá)嵌合干擾素大致可以分為兩種類型：一種是兩種不同類型或同類型而不同亞型的干擾素間進(jìn)展嵌合,另一種是干擾素或其局部序列與其他活性物質(zhì),如抗體、白介素等進(jìn)展嵌合,以便得到新的生物活性產(chǎn)物。下面就這兩種情況分別舉例介紹。?將從基因文庫中調(diào)出的編碼淋巴細(xì)胞干擾素B和D的CDNA連接到大腸桿菌色氨酸啟動子、操縱子、核糖體結(jié)合位點及起始密碼子ATＧ后面,分別構(gòu)成表達(dá)載體pLＹＥN－B和ＰＬy-IFN－Ｄ。為構(gòu)建嵌合干擾素,可先將親代干擾素的編碼序列在一樣位點Ｓ１(Sａ１１３AI)、Ｐv〔PVU

Ｅ)、Ｓ２(Sa１１３AI)切斷,產(chǎn)生含有氨基端１～６０、１～９２、６１～９２、９３～１５０、９３～１６６、１５１～１６６位氨基酸的片段,用６%的聚丙烯釀膠凝膠電泳別離(圖１２４)。將適宜的片段連接，得到嵌合?DNA,將含有嵌合ＤＮA的質(zhì)粒用ＨindE和PsｔＩ切后將酶切片段連接到pＢR３２２的ＨｉｎdＥmpsｔI位點上,將得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,同時對DNA序列進(jìn)展測定。含有轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的大腸桿菌HT－２在M９培養(yǎng)基中培養(yǎng)到OD６５０為５～８時,離心得到細(xì)胞,并用含１００mｍｏIA

Ｔris－ＨＣ１、０.５ｍolＡＮaＣｌ、５mmｏlAEDTA及０．１ＩIIEｎoｌ/LPMSF的pH為８．０的緩沖液重新溶解之。在０℃參加１mg/ｍl溶菌酶,細(xì)胞在溶菌液中裂解。離心后將上清用單克隆抗體親和層析柱純化兩次,將純化后的活性干擾素溶于ＰBS后利用超濾膜ＹM１０濃縮至１～３時,再將濃度調(diào)整到０.１／?IIIgｍlo利用SDS聚丙烯酷膠電泳對于擾素的純度進(jìn)展測定。

IFN-γ及ＴNＦ-R基因已經(jīng)分別被克隆,并用工程菌加以表達(dá)。對其序列的研究說明，IFN-R在竣基端的１３個氨基酸以及TＮF-下在氨基端的２３個氨基酸均對它們的生物活性沒有影響,因此在設(shè)計構(gòu)建ＩFN-γ與TNER嵌合物時可以將其去除,利用色氨酸啟動子構(gòu)建的含有IFＮEγ氨基端１３４個氨基酸及TNF-Ｐ竣基端１４８個氨基酸的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)造見圖１２-５０

此外，基因工程在抗體技術(shù)上的應(yīng)用使干擾素與抗體能夠有機(jī)地結(jié)合,通過抗體的靶向作?用,增強(qiáng)干擾素的定向能力，提高干擾素體內(nèi)作用的效率。

５．提高干擾素產(chǎn)量的方法干擾素是一種誘生物質(zhì),必須在一定的誘生劑如病毒、細(xì)菌等作用不才能生成,所以在基因工程中,常常用一些強(qiáng)啟動子如色氨酸啟動子，將干擾素的表達(dá)從條件型變?yōu)榻M成型,以提高產(chǎn)量。

酵母是一種較為常用的表達(dá)宿主，但其外源基因的大量表達(dá)必須在缺少元機(jī)磷的條件下才能進(jìn)展。通過對其酸性磷酸酶酶的阻遏基因及溫度敏感型負(fù)調(diào)控基因進(jìn)展改造,就可以使酵母菌在３５℃的高溫下生長,在２５℃下誘導(dǎo)表達(dá),并且其表達(dá)與無機(jī)磷的含量無關(guān)。實驗說明未誘導(dǎo)時產(chǎn)量為６×１０４UA,而誘導(dǎo)后產(chǎn)量可到達(dá)１×１０７UA。?由于ＩFＮ-α、自、γ性質(zhì)各異,在進(jìn)展表達(dá)時，ＩFN干的產(chǎn)量往往遠(yuǎn)不及IFN-α、ＩFN-日，因此就必須進(jìn)展表達(dá)體系的改進(jìn)。如利用含噬菌體T５早期啟動子及強(qiáng)核糖體結(jié)合位點的高效轉(zhuǎn)錄二表達(dá)體系,可以使IFN－γ的表達(dá)也到達(dá)４×１０９U／L的水平。其方法為用人工合成的T５P２５強(qiáng)啟動手｛其中含有啟動于及核糖體結(jié)合位點)：取代質(zhì)粒pJP１在EcoＲV與HｉnｄＥ之間的Tｅf啟動子,形成質(zhì)粒pＪR１Ｒ３,將其用ＨindE線性化后插入ＩFＮEＹ的編碼序列,便可以得到高效的表達(dá)質(zhì)粒IFNγ－IFNY。將IFN基因置于Teｔr基因的上游,有利于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的篩選和保持〔圖１２-６)O?其中合成的啟動區(qū)序列為：

E∞RI３５區(qū)－１０區(qū)?GAAIＴCＡAAAATrrAτTＴGＣＴTτ℃AＧGAＡＡAＡＴTTＴI℃IGTAＴAＡT?E丑nd皿?AGＡIτ℃ATAAATTTGAAGCTAＧＧAGGＴＴTAＡGCTT?啟動子核糖體結(jié)合位點四、提取、純化及鑒定對干擾素的提純可分為粗提和進(jìn)一步純化，以IFN-α為例,粗提時將菌液５０００r/min離心取細(xì)胞,參加１／１００體積的７ｍｏl/L鹽酸肌冰?。玻枇呀饧?xì)胞后１７０００r/ｍin離心５min，取上清液。用５～１０倍體積的０．１５mol/L棚酸鹽緩沖液稀釋后在１O(jiān)ＩIIII１０１４的NＨ４Ci中透析２０ｈ,再１５０００r／min離心１０ｒＩlino將上清液用８０%(ＮH４〕２S０４

沉淀,用水溶解后再透析去除(NH４)２S０４,再用離子交換的方式別離各種蛋白O如果要進(jìn)一步純化,可用單克隆抗體進(jìn)展親和層析。將Sepｈarose４Ｂ與純化的抗IFN-α單克隆抗體混合振搖，室溫放置４ｈ后低速離心，并用０.１Eｎoｌ/L=Ｎ注fC０３(ｐH８.５)的緩沖液洗去未結(jié)合的抗體,參加等體、積的乙醇膠并振蕩４h以上,將殘存的活性基團(tuán)加以封閉O：用ｐH４.０的醋酸鹽緩沖液及ｐH８.０的Tｒｉｓ－HCｌ緩沖液交ｉ?替洗滌３次,并用pＨ７.５的０.１molＡTrｉSEHCｉ加以平衡１后裝柱。用ｐH７.２的０.０１molJLPＢＳ洗柱至洗脫液‘OＩh８０到基線，將含有IFN的混合液上樣,如一次吸附不完A全可用流出液再上柱一次。用PＢS反復(fù)洗柱，至流出液的１吸收回到基線。用pH２．５的０.１mｏlAGly－ＨCl洗脫并分４段收集,并對各局部濃度進(jìn)展測定。最后用ｐH２．５的０.１ｍolＡGｌｙ-ＨCｌ再生,用含０．０１%間的PBS沖洗凈,４℃保存。同時,利用親和層析技術(shù)還可以對只占總蛋白０.１％～１%的干擾素進(jìn)展別離和濃縮。

五、活性檢測

１.對(３二５')ｏligo(A)合成酶活性的誘導(dǎo)在含１％小牛血清?的RPMＩ１６４０培養(yǎng)基中培養(yǎng)２×１０５個／mlDaｕｄi細(xì)胞,并分別參加１U/m１、１０Ｕ/ｍl、１００U/ｍl、１０００Ｕ/mlＩFN。２４h后９０００r/ｍiｎ離心２min,并將沉淀分散于５００μL冷的含２０mmoiAEｆEP－ES、５mmｏl／ＬMgCl２、I２０ｍmol只LKCl、７mm０１４二硫蘇糖醇、１０%甘氨酸、０５%ＮＰ４０(pH７.５)的裂解液中,冰?。瞞iｎ后９OOＯr/ｍｉn離心８IIlino取上清與５０μＬｐoly(rI)：ｐｏly〔rC〕瓊脂在３０℃共浴１５min,離心去除未吸附局部，而將結(jié)合物與２．５mmolA[α－３２p］－ATP及磷酸激酶在３０℃水?。玻癶。將混合物上３０μL酸性磯土柱,用３ｍllｍolA鹽酸肌洗脫,將洗脫液與未用IFN誘導(dǎo)的對照組進(jìn)展比較便可測出IＦN的活性。

２．抗增生活性在含１５%小牛血清的RPMI１６４０培養(yǎng)基中培養(yǎng)５×１０４個／ｍlDａｕｄa細(xì)胞，４８h后參加IFＮ，再培養(yǎng)７２h,用２BI型庫爾特計數(shù)器對細(xì)胞進(jìn)展計數(shù)，即可以得到IＦN的抗增生活性。

３.細(xì)胞病變抑制作用將在含１０%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)的ＷISH細(xì)胞用０.０３%ＥDＴＡ、０.２５%的膜蛋白酶１mi在室溫下消化２～３min后,倒出消化液,用Eａgle液分散細(xì)胞,然后用含１０％小牛血清的DMEM液配成５×１０５個/mｌ的細(xì)胞懸液，用微量板在

３７℃含５%C馬的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。用不同稀釋度的０.１mlＩＦN溶液參加各孔后再培養(yǎng)７h。每孔參加０.１ｍl含１００～１０００ＴｃID５０濾過性口腔炎病毒(VＳV〕進(jìn)展病毒攻擊。將病毒對照組與細(xì)胞對照組進(jìn)展比較便可以測得其抗病毒活性。?六、新型干擾素

１．活性增加的干擾素通過定點突變或干擾素的嵌合可提高干擾素的活性,如將重組干

擾素自１７位的Cys改為Ser,可提高抗病毒活性１０倍。新型雜合的IFN-αD對NＫ細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力比親本提高了１０～４００倍,如將IＦN－α４與IＦＮtｌ進(jìn)展嵌合,得到的IＦN活性分別是親代的４倍及２０倍。而用鼠ＩFNｔ１的A段與IFN-飩的Ｂ段進(jìn)展雜交,活性可提高１０～１００倍。此外,如上面介紹的將IＦN與TNＦ結(jié)合,可以產(chǎn)生不同的活性。

２．穩(wěn)定性增加的干擾素仍以上面提到的重組ＩＦＮR為例,親代干擾素在一７０℃７５d后

大多數(shù)喪失抗病毒活性,而突變后在同樣條件下保存１５０d仍不失活。

３.改變抗原性的干擾素如將IFN仇的１４１位上Cys用Ｔｙr代替，那么其抗原性發(fā)生改變,不與體內(nèi)自然存在的IFＮ在１爭奪受體，雖然這種抗原性改變的機(jī)率很小，但仍不失為一種研究方向。?４．改變種屬特異性的干擾素IＦN－αＤ在牛細(xì)胞株中活性最高,IFN-αA在人細(xì)胞系中活

性最高,而其嵌合體與兩個親本都不一樣,在鼠細(xì)胞中的活性最高。第三節(jié)應(yīng)用一、臨床治療方面?干擾素作為較早被研究的用基因工程方法合成的生物活性物質(zhì),雖然在基因的調(diào)取、構(gòu)建、表達(dá)方面仍有較多的工作在進(jìn)展中,但研究的熱點已經(jīng)轉(zhuǎn)移到了臨床應(yīng)用及臨床前的動物實驗方面，并且在較多疾病的治療方面取得了進(jìn)展。

１.抗病毒目前的研究主要集中于抗各類肝炎病毒方面,在抗HＩV、抗HSV等方面也有?較多的研究。

２.提高免疫系統(tǒng)機(jī)能在小鼠實驗中重組ＩFN－γ對NK細(xì)胞的活性、吞噬細(xì)胞的溶解性、絲裂原誘導(dǎo)的母細(xì)胞化均有促進(jìn)作用,同時減少外周血及骨髓量。在牛體