2020生物導(dǎo)學(xué)提分教程人教選修一講義專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題3

課題3血紅蛋白的提取和分離[學(xué)習(xí)目標(biāo)]1.了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。2.體驗從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程與方法。知識點一蛋白質(zhì)分離的原理和方法知識梳理1.原理蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和eq\o(□,\s\up4(01))大小、所帶電荷的eq\o(□,\s\up4(02))性質(zhì)和eq\o(□,\s\up4(03))多少，eq\o(□,\s\up4(04))溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等方面的差異均可用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。2．凝膠色譜法(1)概念：凝膠色譜法也稱做eq\o(□,\s\up4(01))分配色譜法，是根據(jù)eq\o(□,\s\up4(02))相對分子質(zhì)量的大小分離eq\o(□,\s\up4(03))蛋白質(zhì)的有效方法。(3)常用凝膠：eq\o(□,\s\up4(07))葡聚糖和瓊脂糖。(4)分離過程①分離過程示意圖②分離原理相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程eq\o(□,\s\up4(08))較長，移動速度eq\o(□,\s\up4(09))較慢，通過凝膠的時間eq\o(□,\s\up4(10))較長；相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠eq\o(□,\s\up4(11))外部移動，路程eq\o(□,\s\up4(12))較短，移動速度eq\o(□,\s\up4(13))較快，通過凝膠的時間eq\o(□,\s\up4(14))較短，因此可將各種相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分離。3．電泳(1)概念：是指eq\o(□,\s\up4(01))帶電粒子在eq\o(□,\s\up4(02))電場的作用下發(fā)生eq\o(□,\s\up4(03))遷移的過程。(2)原理(3)常用的電泳方法：eq\o(□,\s\up4(04))瓊脂糖凝膠電泳和eq\o(□,\s\up4(05))聚丙烯酰胺凝膠電泳。①瓊脂糖凝膠電泳：由于瓊脂糖本身不帶電荷，各種分子在電場中遷移速率決定于eq\o(□,\s\up4(06))所帶電荷性質(zhì)的差異及分子的eq\o(□,\s\up4(07))大小、形狀的不同。②聚丙烯酰胺凝膠電泳：在凝膠中加入eq\o(□,\s\up4(08))SDS，使蛋白質(zhì)解聚成單鏈，SDS與各種蛋白質(zhì)形成eq\o(□,\s\up4(09))蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶電荷較多能掩蓋不同蛋白質(zhì)間eq\o(□,\s\up4(10))電荷差別，使其遷移速率完全取決于eq\o(□,\s\up4(11))分子的大小。4．緩沖溶液(1)作用在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界eq\o(□,\s\up4(01))酸和eq\o(□,\s\up4(02))堿對溶液eq\o(□,\s\up4(03))pH的影響，維持pH基本不變。(2)配制緩沖溶液通常由eq\o(□,\s\up4(04))1～2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。1.什么是洗脫？提示：洗脫是指從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。2．緩沖液有何作用？為何要維持反應(yīng)體系的pH不變？提示：緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的pH基本不變。為了在實驗條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的過程，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有與體內(nèi)過程基本相同的pH。3．人體血漿中存在的緩沖對有哪些？提示：NaH2PO4/Na2HPO4，H2CO3/NaHCO3。典題分析題型一對凝膠色譜法原理的考查[例1]相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的擴(kuò)散過程，可表示為下圖中()解題分析凝膠小球體內(nèi)有許多貫穿的通道，當(dāng)相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快，即分子量大的物質(zhì)移動速度快于分子量小的物質(zhì)，B正確。答案B題后歸納凝膠色譜法的原理總結(jié)題型二凝膠色譜法和電泳法的比較[例2]有關(guān)凝膠色譜法和電泳法的說法正確的是()A．它們都是分離蛋白質(zhì)的重要方法B．它們的原理相同C．使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不需要D．以上說法都正確解題分析凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的一種有效方法；電泳法是利用待測樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異和分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離或鑒定，A正確，B錯誤；這兩種方法都用到緩沖溶液，以調(diào)節(jié)溶液的酸堿度，C錯誤。答案A題后歸納凝膠色譜法與電泳法的比較知識點二血紅蛋白的提取和分離實驗操作知識梳理1.實驗流程蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、eq\o(□,\s\up4(01))純化和eq\o(□,\s\up4(02))純度鑒定。2．實驗操作(1)樣品處理步驟目的過程①紅細(xì)胞的洗滌去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化eq\o(□,\s\up4(01))分離(低速短時間離心)→用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿→下層暗紅色的紅細(xì)胞用五倍體積的eq\o(□,\s\up4(02))生理鹽水洗滌三次②血紅蛋白的釋放使紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中→加eq\o(□,\s\up4(03))蒸餾水至原血液的體積→加40%體積的eq\o(□,\s\up4(04))甲苯→置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0min續(xù)表步驟目的過程③分離血紅蛋白溶液經(jīng)過eq\o(□,\s\up4(05))離心使血紅蛋白溶液和其他雜質(zhì)分離，便于下一步對血紅蛋白溶液的純化將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移至離心管中，以2000r/min的速度離心10min(高速長時間)→用eq\o(□,\s\up4(06))濾紙過濾試管中的液體，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的血紅蛋白溶液(2)粗分離(透析)①原理：透析袋能使eq\o(□,\s\up4(07))小分子自由進(jìn)出，而將eq\o(□,\s\up4(08))大分子保留在袋內(nèi)。②過程：取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的eq\o(□,\s\up4(09))磷酸緩沖液中(pH為7.0)，透析eq\o(□,\s\up4(10))12h。③目的：a.除去樣品中相對分子質(zhì)量eq\o(□,\s\up4(11))較小的雜質(zhì)；b.用于更換樣品的緩沖液。(3)純化①凝膠色譜柱的制作a．取長40cm，內(nèi)徑為1.6cm的玻璃管，兩端需用砂紙磨平；b．柱底部制作：橡皮塞中間打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗將上部包好；c．柱頂部制作：橡皮塞中間打孔→安裝玻璃管。②凝膠色譜柱的裝填③樣品的加入和洗脫(純化)(4)純度鑒定對蛋白質(zhì)純度的鑒定，使用最多的是eq\o(□,\s\up4(20))SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。(5)操作提示①離心除雜蛋白時，離心時轉(zhuǎn)速eq\o(□,\s\up4(21))要低，離心時間eq\o(□,\s\up4(22))要短，一般為500r/min，離心2min，否則會使白細(xì)胞一同沉淀，達(dá)不到分離效果。洗滌三次后如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則血漿蛋白無法除凈。②商品凝膠是干燥的顆粒，使用前需要直接放在eq\o(□,\s\up4(23))洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可以將加入eq\o(□,\s\up4(24))洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，逐漸升溫接近至沸騰，通常只需1～2h。這種方法不但節(jié)約時間，而且可以除去凝膠中可能帶有的eq\o(□,\s\up4(25))微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣。③在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。一是在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的eq\o(□,\s\up4(26))洗脫次序，降低分離效果。二是在凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液eq\o(□,\s\up4(27))流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要eq\o(□,\s\up4(28))重新裝填。④滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，不要破壞凝膠面。在蛋白質(zhì)分離過程中，仔細(xì)觀察紅色區(qū)帶在洗脫過程中的移動情況，如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。根據(jù)紅色區(qū)帶的移動狀況判斷收集流出液的時間，待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5mL收集一試管，連續(xù)收集。3．結(jié)果分析與評價項目分析血液樣品的處理①分層明顯→樣品處理完成；②分層不明顯的原因：a.洗滌次數(shù)少，未能除去血漿蛋白，b.離心速度過高或時間過長凝膠色譜柱的裝填凝膠顆粒填充緊密、均勻，無氣泡→裝填成功血紅蛋白的分離血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨洗脫液緩慢流出→分離成功1.為什么選擇哺乳動物紅細(xì)胞作為實驗材料？提示：哺乳動物的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹的圓餅狀，沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器。在血漿中，紅細(xì)胞的含量最多，而且在紅細(xì)胞的組成中，90%為血紅蛋白，易提取分離。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候收集流出液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。2．血液的成分有哪些？提示：血液由血漿和血細(xì)胞組成，血漿中又含有水、無機(jī)鹽、葡萄糖、血漿蛋白等成分，而血細(xì)胞由紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板構(gòu)成。3．如何防止血液凝固？提示：在采血容器中預(yù)先加入抗凝血劑檸檬酸鈉。4．如果紅細(xì)胞洗滌不充分，對實驗結(jié)果有何影響？提示：如果紅細(xì)胞洗滌不充分，則離心后分層不明顯。雜蛋白較多，不利于后續(xù)的純化操作。典題分析題型三明確“血紅蛋白提取與分離”中各種試劑的作用[例3]在提取和分離豬血紅蛋白的實驗中，應(yīng)使用()A．檸檬酸鈉溶液洗滌紅細(xì)胞，防止紅細(xì)胞破裂B．蒸餾水和甲苯處理紅細(xì)胞，使其釋放出血紅蛋白C．生理鹽水透析血紅蛋白溶液，保持血紅蛋白活性D．生理鹽水洗脫，有利于血紅蛋白在凝膠柱中移動解題分析檸檬酸鈉可與血漿中的鈣離子結(jié)合，防止血液凝固，用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，可防止紅細(xì)胞破裂，A錯誤；在蒸餾水和甲苯的作用下，紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白，B正確；透析用的是磷酸緩沖液，C錯誤；磷酸緩沖液有利于血紅蛋白在凝膠柱中移動，D錯誤。答案B題后歸納(1)檸檬酸鈉：抗凝劑，防止血液凝固。(2)甲苯：有機(jī)溶劑，可以溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。(3)生理鹽水：與人體滲透壓等滲，維持紅細(xì)胞的正常形態(tài)。(4)蒸餾水：比人體滲透壓低，能使紅細(xì)胞漲破。(5)緩沖液：維持體外溶液的pH，本實驗中常用的是磷酸緩沖液。磷酸緩沖液在本實驗中還用于樣品的洗脫。題型四DNA與蛋白質(zhì)的提取與分離的比較[例4]下列關(guān)于DNA的粗提取實驗和血紅蛋白的提取實驗，敘述正確的是()A．前者選擇雞血細(xì)胞作為實驗材料較好，后者選擇哺乳動物成熟的紅細(xì)胞作實驗材料較好B．樣品預(yù)處理時，前者靜置1天處理除去上清液；后者需要加入清水，反復(fù)低速短時間離心洗滌，至上清液無黃色C．在DNA粗提取實驗中，往2mol/L氯化鈉溶液中加入蒸餾水析出DNA時，應(yīng)該緩慢加入，直到出現(xiàn)黏稠物即止D．洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無機(jī)鹽等解題分析DNA的粗提取實驗中選擇雞血細(xì)胞作為實驗材料較好，血紅蛋白的提取實驗中選擇哺乳動物成熟的紅細(xì)胞(沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器)作實驗材料較好，A正確；樣品預(yù)處理時，前者靜置1天處理除去上清液，后者需要加入生理鹽水，反復(fù)低速短時間離心洗滌，至上清液無黃色，B錯誤；在DNA粗提取實驗中，往2mol/L氯化鈉溶液中加入蒸餾水析出DNA時，應(yīng)該緩慢加入，直到黏稠物不再增加即止，C錯誤；洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，利于后續(xù)步驟的分離純化，D錯誤。答案A題后歸納比較DNA與蛋白質(zhì)的提取實驗課堂小結(jié)當(dāng)堂檢測——查漏補缺鞏固提升1.凝膠色譜法是分離蛋白質(zhì)分子的一種常用方法。但并非所有的蛋白質(zhì)都可用此方法進(jìn)行分離。能分離的蛋白質(zhì)分子之間必須()A．具有相同的相對分子質(zhì)量B．相對分子質(zhì)量不同，但都是相對分子質(zhì)量較大的分子C．相對分子質(zhì)量不同，但都是相對分子質(zhì)量較小的分子D．具有不同的相對分子質(zhì)量答案D解析對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)的各種分子，根據(jù)其相對分子質(zhì)量不同，通過凝膠色譜柱的快慢程度不同來進(jìn)行分離。2．有關(guān)蛋白質(zhì)的提取分離過程的敘述中錯誤的是()A．在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對溶液pH的影響，維持pH基本不變B．緩沖溶液通常由1～2種緩沖劑溶解于水中配制而成C．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程D．透析袋能使大分子自由進(jìn)出，而將小分子保留在袋內(nèi)答案D解析透析袋一般是用硝酸纖維素(又叫玻璃紙)制成的。透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。3．蛋白質(zhì)的提取和分離分為哪幾步()A．樣品處理、凝膠色譜操作、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳B．樣品處理、凝膠色譜操作、純化C．樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定D．樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定答案C解析蛋白質(zhì)的提取和分離分為樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定四步。A項中SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳為實驗操作過程中的技術(shù)。4．下列關(guān)于血紅蛋白提取和分離實驗中樣品處理步驟的描述，正確的是()A．紅細(xì)胞的洗滌：加入蒸餾水，緩慢攪拌，低速短時間離心B．血紅蛋白的釋放：加入生理鹽水和甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢鐲．分離血紅蛋白：將攪拌好的混合液離心、過濾后，用分液漏斗分離D．透析：將血紅蛋白溶液裝入透析袋，然后置于pH為4.0的磷酸緩沖液中透析12h答案C解析紅細(xì)胞洗滌過程中應(yīng)該用生理鹽水，不能用蒸餾水，A錯誤；血紅蛋白的釋放應(yīng)該加入蒸餾水和甲苯，使紅細(xì)胞吸水漲破，釋放其中的血紅蛋白，B錯誤；將攪拌好的混合液通過離心、過濾后，用分液漏斗