微生物的培養(yǎng)基一專家講座

微生物包含哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動(dòng)物特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單,多數(shù)個(gè)體十分微小(<o.1mm)生物總稱。通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)普通不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.

原核

原生生物界真菌界病毒界真核微生物的培養(yǎng)基一專家講座第1頁(yè)微生物的培養(yǎng)基一專家講座第2頁(yè)病毒

微生物的培養(yǎng)基一專家講座第3頁(yè)SARS病毒禽流感病毒微生物的培養(yǎng)基一專家講座第4頁(yè)朊病毒（蛋白質(zhì)病毒）微生物的培養(yǎng)基一專家講座第5頁(yè)真菌微生物的培養(yǎng)基一專家講座第6頁(yè)如圖是酵母菌電子顯微鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)酵母菌和霉菌青霉微生物的培養(yǎng)基一專家講座第7頁(yè)

了解相關(guān)培養(yǎng)基基礎(chǔ)知識(shí)，進(jìn)行無(wú)菌技術(shù)操作，進(jìn)行微生物培養(yǎng)。

一、課題目標(biāo)：

掌握培養(yǎng)基制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進(jìn)行無(wú)菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無(wú)菌技術(shù)操作。二、課題重點(diǎn)和難點(diǎn)：三、技能目標(biāo)：微生物的培養(yǎng)基一專家講座第8頁(yè)（2）按培養(yǎng)基物理形態(tài)分：液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基一基礎(chǔ)知識(shí):（3）按培養(yǎng)基功效分：P12基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基判別培養(yǎng)基（1）按培養(yǎng)基化學(xué)成份分：·天然培養(yǎng)基·合成培養(yǎng)基·半合成培養(yǎng)基閱讀書本P8第三段分別說(shuō)出它們優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)。微生物的培養(yǎng)基一專家講座第9頁(yè)各種培養(yǎng)基詳細(xì)配方不一樣，但普通都包含哪些成份？答：不論哪種培養(yǎng)基，普通都含有水、碳源、和氮源、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

注：另外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),比如:生長(zhǎng)因子(即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而本身不能合成化合物,如維生素、一些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等要求。

微生物的培養(yǎng)基一專家講座第10頁(yè)微生物的培養(yǎng)基一專家講座第11頁(yè)二無(wú)菌技術(shù)：無(wú)菌操作泛指在培養(yǎng)微生物操作中，全部預(yù)防雜菌污染方法。閱讀P8---P9說(shuō)出消毒和滅菌有何不一樣？1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)慣用消毒方法：微生物的培養(yǎng)基一專家講座第12頁(yè)1、灼燒滅菌:2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)慣用滅菌方法：微生物的培養(yǎng)基一專家講座第13頁(yè)分類定義方法滅菌法殺滅一切微生物物理法：熱力、輻射、微波、等離子體化學(xué)法：醛類、烷化劑高效消毒法殺滅一切致病微生物紫外線、含氯劑、臭氧、復(fù)配劑等中效消毒法殺滅除芽孢外致病微生物超聲波、碘類、醇類、酚類低效消毒法殺滅細(xì)菌繁殖體、親脂病毒單鏈季胺鹽、雙胍類、中草藥、金屬離子無(wú)菌技術(shù)：微生物的培養(yǎng)基一專家講座第14頁(yè)常

識(shí)1．無(wú)菌技術(shù)包含：（1）對(duì)試驗(yàn)操作空間、操作者衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行

滅菌

；（3）為防止周圍微生物污染，試驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近

旁進(jìn)行；（4）防止已滅菌處理材料用具與

周圍物品

相接觸。2．消毒方法：（1）日常生活經(jīng)慣用到是

煮沸消毒法；（2）對(duì)一些不耐高溫液體，則使用

巴氏

消毒法（作簡(jiǎn)明介紹）；（3）對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用

紫外線進(jìn)行物理消毒。（4）試驗(yàn)操作者雙手使用酒精進(jìn)行消毒；（5）飲水水源用氯氣進(jìn)行消毒。3．滅菌方法：（1）接種環(huán)、接種針、試管口等使用

灼燒

滅菌法；（2）玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是

干熱滅菌箱；（3）培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用高壓蒸汽

滅菌法，所用器械是

高壓蒸汽滅菌鍋。（4）表面滅菌和空氣滅菌等使用

紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。微生物的培養(yǎng)基一專家講座第15頁(yè)三、試驗(yàn)操作1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）微生物的培養(yǎng)基一專家講座第16頁(yè)【補(bǔ)充】培養(yǎng)基配制標(biāo)準(zhǔn)：①目標(biāo)要明確：依據(jù)培養(yǎng)微生物種類、培養(yǎng)目標(biāo)等確定培養(yǎng)基類型和配制量。②營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)：培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度和百分比要適宜。比如：碳氮比4∶1時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖而產(chǎn)生谷氨酸少；碳氮比為3∶1時(shí)，菌體繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。③pH要適宜：細(xì)菌培養(yǎng)基pH中性或偏堿性，霉菌培養(yǎng)基呈酸性。微生物的培養(yǎng)基一專家講座第17頁(yè)1．配制：計(jì)算、稱量、熔化2．調(diào)整pH：用3%HCI/NaOH調(diào)整

pH7．0---7．23．分裝：分裝過(guò)程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引發(fā)污染。分裝三角燒瓶量以不超出三角燒瓶容積二分之一為宜。4．包扎：操作步驟:微生物的培養(yǎng)基一專家講座第18頁(yè)5．滅菌:

將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。

6．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無(wú)雜菌污染才可用來(lái)接種.7．無(wú)菌檢驗(yàn)：將滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫室中培養(yǎng)24—48小時(shí)，以檢驗(yàn)滅菌是否徹底。微生物的培養(yǎng)基一專家講座第19頁(yè)倒平板:微生物的培養(yǎng)基一專家講座第20頁(yè)菌種保留1、暫時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保留。

2、長(zhǎng)久保留：甘油冷凍管藏法微生物的培養(yǎng)基一專家講座第21頁(yè)1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么方法來(lái)預(yù)計(jì)培養(yǎng)基溫度？問(wèn)題討論

答：能夠用手觸摸盛有培養(yǎng)基錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶溫度下降到剛才不燙手時(shí)，就能夠進(jìn)行倒平板了。2.為何需要使錐形瓶瓶口經(jīng)過(guò)火焰？

答：經(jīng)過(guò)灼燒滅菌，預(yù)防瓶口微生物污染培養(yǎng)基。注意:微生物的培養(yǎng)基一專家講座第22頁(yè)3.平板冷凝后，為何要將平板倒置？4.在倒平板過(guò)程中，假如不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為何？

答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后培養(yǎng)基表面濕度也比較高，將平板倒置，既能夠使培養(yǎng)基表面水分更加好地?fù)]發(fā)，又能夠預(yù)防皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

答：空氣中微生物可能在皿蓋與皿底之間培養(yǎng)基上滋生，所以最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。微生物的培養(yǎng)基一專家講座第23頁(yè)選擇培養(yǎng)基加入青霉素培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源無(wú)氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機(jī)物無(wú)碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素培養(yǎng)基:

分離導(dǎo)入了目標(biāo)基因受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基:

分離雜交瘤細(xì)胞微生物的培養(yǎng)基一專家講座第24頁(yè)2、純化大腸桿菌:接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法

平板劃線法:經(jīng)過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線操作,將聚集菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面.

在數(shù)次畫線后,能夠分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)肉眼可見子細(xì)胞群體,這就是菌落.微生物接種技術(shù)微生物的培養(yǎng)基一專家講座第25頁(yè)微生物的培養(yǎng)基一專家講座第26頁(yè)劃線后培養(yǎng)一段時(shí)間后微生物的培養(yǎng)基一專家講座第27頁(yè)微生物恒溫培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基一專家講座第28頁(yè)微生物恒溫培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基一專家講座第29頁(yè)問(wèn)題討論

1.為何在操作第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，依然需要灼燒接種環(huán)嗎？為何？

答：操作第一步灼燒接種環(huán)是為了防止接種環(huán)上可能存在微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上菌種直接起源于上次劃線末端，從而經(jīng)過(guò)劃線次數(shù)增加，使每次劃線時(shí)菌種數(shù)目逐步降低，方便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留菌種，防止細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。微生物的培養(yǎng)基一專家講座第30頁(yè)

2.在灼燒接種環(huán)之后，為何要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后劃線操作時(shí)，為何總是從上一次劃線末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線末端開始，能使細(xì)菌數(shù)目伴隨劃線次數(shù)增加而逐步降低，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)菌落。微生物的培養(yǎng)基一專家講座第31頁(yè)四、課題結(jié)果評(píng)價(jià)

（一）培養(yǎng)基制作是否合格假如未接種培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基制備是成功，不然需要重新制備。（二）接種操作是否符合無(wú)菌要求假如培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落特點(diǎn)，則說(shuō)明接種操作是符合要求；假如培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其它菌落，則說(shuō)明接種過(guò)程中，無(wú)菌操作還未到達(dá)要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致觀察與統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)12h與24h后大腸桿菌菌落大小會(huì)有顯著不一樣，及時(shí)觀察統(tǒng)計(jì)同學(xué)會(huì)發(fā)覺(jué)這一點(diǎn)，并能觀察到其它一些細(xì)微改變。這一步要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。微生物的培養(yǎng)基一專家講座第32頁(yè)本課題知識(shí)小結(jié):微生物的培養(yǎng)基一專家講座第33頁(yè)【典例解析】

例1．關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)敘述中，正確是:A.是碳源物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外無(wú)機(jī)物只提供無(wú)機(jī)鹽D.無(wú)機(jī)氮源也能提供能量

解析：不一樣微生物，所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較大差異，要針對(duì)微生物詳細(xì)情況分析。對(duì)于A、B選項(xiàng)，它表示是不完整。有碳源只能是碳源，如二氧化碳；有碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有碳源同時(shí)是氮源，也是能源，如蛋白胨。對(duì)于C選項(xiàng)，除水以外無(wú)機(jī)物種類繁多，功效也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物碳源和無(wú)機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無(wú)機(jī)鹽。對(duì)于D選項(xiàng)，無(wú)機(jī)氮源提供能量情況還是存在，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。答案：D微生物的培養(yǎng)基一專家講座第34頁(yè)例2．下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌了解不正確是:A.預(yù)防雜菌污染B.毀滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前答案：B

解析：滅菌是微生物發(fā)酵過(guò)程一個(gè)主要步驟。A說(shuō)是滅菌目標(biāo)，因?yàn)榘l(fā)酵所用菌種大多是單一純種，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程不能混入其它微生物（雜菌），所以是正確；B是錯(cuò)誤，因?yàn)闇缇繕?biāo)是預(yù)防雜菌污染，但實(shí)際操作中不可能只毀滅雜菌，而是毀滅全部微生物。C是正確，因?yàn)榕c發(fā)酵相關(guān)全部設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用微生物是滅菌后專門接種，滅菌必須在接種前，假如接種后再滅菌就會(huì)把所接菌種也殺死。微生物的培養(yǎng)基一專家講座第35頁(yè)編號(hào)成份含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成份，請(qǐng)據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)微生物類型是

（2）若不慎將過(guò)量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費(fèi)此培養(yǎng)基，可再加入

.用于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌.自養(yǎng)型微生物

含碳有機(jī)物

微生物的培養(yǎng)基一專家講座第36頁(yè)（3）若除去成份②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)

。（4）表中營(yíng)養(yǎng)成份共有

類。（5）不論何種培養(yǎng)基，