基因工程復(fù)習(xí)課

基因工程復(fù)習(xí)課第1頁(yè)/共24頁(yè).第2頁(yè)/共24頁(yè)一、基因工程的概念

。二、基因工程的基本工具1.“分子手術(shù)刀”—

限制性內(nèi)切酶

（1）來(lái)源：主要是從

原核生中物分離純化出來(lái)的。（2）功能：使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的

鍵斷開.（磷3）酸結(jié)二果酯：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端

和

平末端2.“分子縫合針”—

DNA連接酶

。與DNA聚合酶作用的異同:DNA聚合酶只能將

單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接

兩個(gè)DNA片段

的末端，形成磷酸二酯鍵。自主檢測(cè)3.“分子運(yùn)輸車”—

載體

。（1）載體具備的條件：①

。。。第3頁(yè)/共24頁(yè)。能在②受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存③具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA片段插入。具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇（2）最常用的載體是

,它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于

質(zhì)粒

，并具有

的雙鏈

細(xì)菌DN染A分色子體。DNA之外 自我復(fù)制能力（3）其它環(huán)載體狀：

。

三、基因工程的噬基菌本體操的作衍程生序物、動(dòng)植物病毒第一步：

。1.目的基因目是的指基：因的獲取2.人工合成目的基因編常碼用蛋方白法有質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因和化學(xué)合成 反轉(zhuǎn)錄法第二步：

基因表達(dá)載體的構(gòu)建

。

1.組成：

目的基因

＋

標(biāo)記基因＋

啟動(dòng)子＋

終止子。

（1）啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的

DNA片段

，位于基因的首端

，是

RNA聚合酶

識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出

mRNA，最終獲得所需的

蛋白質(zhì)

。終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的

DNA片段

，位于基因的

尾端

。標(biāo)記基因：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將

含目的基因的細(xì)胞

篩選出來(lái)。常用的標(biāo)記基因是

抗生素基因

。。第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第4頁(yè)/共24頁(yè)1.轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體.。

細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程2.常用的轉(zhuǎn)化方法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。①農(nóng)桿菌特點(diǎn)，易感染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)

單子葉

植物沒有感染力；②將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞：最常用的方法

顯微注射技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是

受精卵

。第四步：

目的基因的檢測(cè)和表達(dá)

。首先要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入目的基因， 方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。其次還要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了

mRNA

，方法是采 用

用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。

最后檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)

，方法是從轉(zhuǎn)基因 生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原－抗體雜。交有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平

的鑒定。第5頁(yè)/共24頁(yè)磷酸二酯鍵第6頁(yè)/共24頁(yè)作用部位：磷酸二酯鍵B.

DNA連接酶第7頁(yè)/共24頁(yè)②特點(diǎn)：特異性

(兩個(gè)“特定”）。①作用：能切斷外來(lái)的。DNA③作用部位：（3）主干知識(shí)磷酸二酯鍵A.限制性內(nèi)切酶第8頁(yè)/共24頁(yè)點(diǎn)撥黏性末端黏性末端EcoRⅠ第9頁(yè)/共24頁(yè)點(diǎn)撥:2.運(yùn)載體：常用質(zhì)粒質(zhì)粒特點(diǎn)：1、細(xì)菌染色體外很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子2、能自我復(fù)制并在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在3、有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)4、有特殊的遺傳標(biāo)記基因注意：真正用作運(yùn)載體的質(zhì)粒都是人工改造過(guò)的。第10頁(yè)/共24頁(yè)（4）易錯(cuò)點(diǎn)提醒①運(yùn)載體不是酶。②限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用部位都是磷酸二酯鍵。?

DNA分子中氫鍵的形成不需要酶的 化。④數(shù)量關(guān)系：限制酶切線性DNA一個(gè)切口，可得

2個(gè)DNA片段；切環(huán)狀DNA一個(gè)切口，可得1個(gè)DNA片段.第11頁(yè)/共24頁(yè)①目的基因與運(yùn)載體結(jié)合需要的工具酶：

。B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合②目的基因與運(yùn)載體結(jié)合的結(jié)果可能有：。第12頁(yè)/共24頁(yè)同種限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶目的基因與目的基因結(jié)合；質(zhì)粒與質(zhì)粒結(jié)合；目的基因與質(zhì)粒結(jié)合（4）易錯(cuò)點(diǎn)提醒第13頁(yè)/共24頁(yè)檢測(cè)方法①:分子水平:檢測(cè)基因是否導(dǎo)入了細(xì)胞——DNA分子雜交；檢測(cè)基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA——用基因探針與mRNA雜交；檢測(cè)基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)——提取蛋白質(zhì)，用抗體與抗原特異性結(jié)合。②個(gè)體水平:如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。基因工程步驟中，只有第一、二、四步發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)。（3）主干知識(shí)點(diǎn)基因診斷的原理：DNA分子雜交基因治療的原理：

把

正常的外源基因

導(dǎo)入有

基因缺陷

的細(xì)胞中，達(dá)到治療疾病的目的。第14頁(yè)/共24頁(yè)（4）易錯(cuò)點(diǎn)提醒第15頁(yè)/共24頁(yè)①若受精卵時(shí)進(jìn)行基因治療，則個(gè)體中每個(gè)細(xì)胞都含有正?；?。若對(duì)患者局部進(jìn)行基因治療，則只有該部位有正常基因。②基因治療不能使缺陷基因改變?yōu)檎；?。?/p>

DNA黏性末端黏合，不屬于DNA分子雜交。如下圖所示，兩個(gè)核酸片段在適宜的條件下，經(jīng)X酶的催化作用，發(fā)生下述變化，則X酶是（

）A．DNA連接酶

B．RNA聚合酶

C．DNA聚合酶

D．限制酶A第16頁(yè)/共24頁(yè)例題1采用基因工程技術(shù)將人凝血因子基因?qū)肷窖蚴芫?，培育出了轉(zhuǎn)基因羊。但是，人凝血因子只存在于該轉(zhuǎn)基因羊的乳汁中。以下有關(guān)敘述，正確的是(第17頁(yè)/共24頁(yè))人體細(xì)胞中凝血因子基因編碼區(qū)的堿基對(duì)數(shù)目，等于凝血因子氨基酸數(shù)目的3倍在該轉(zhuǎn)基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺細(xì)胞，而不存在于其他體細(xì)胞中可用顯微注射技術(shù)將含有人凝血因子基因的重組

DNA分子導(dǎo)入羊的受精卵人凝血因子基因開始轉(zhuǎn)錄后，DNA連接酶以DNA分子的一條鏈為模板合成mRNAC繼哺乳動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器研發(fā)成功后，膀胱生物反應(yīng)器的研究也取得了一定進(jìn)展。最近科學(xué)家培育出一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長(zhǎng)激素并分泌到尿液中。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫荏w細(xì)胞，常用方法是

。.。顯微注射法第18頁(yè)/共24頁(yè)（2）進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移時(shí)，通常要將外源基因轉(zhuǎn)入受精卵（或早期胚胎.

）轉(zhuǎn)入去核的卵細(xì)胞中構(gòu)成重組細(xì)胞，使其發(fā)育成與供體具通常采用

DNA分子雜交（核酸探針）技術(shù)檢測(cè)外源基因是否插入了小鼠的基因組。在研制膀胱生物反應(yīng)器時(shí)，應(yīng)使外源基因在小鼠的膀胱上皮

.細(xì)胞中特異表達(dá)。為使外源基因在后代長(zhǎng)期保持，可將轉(zhuǎn)基因小鼠體細(xì)胞的細(xì)胞核中，原因受精卵（或早期胚胎細(xì)胞）具有全能性，可使外源基因在有相同性狀的個(gè)體。該技術(shù)稱為

核移植（或克?。?/p>

。相應(yīng)組織細(xì)胞表達(dá)獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

a

處，DNA連接酶作用于

a

處。（填“a”或“b”）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和

基因槍法（花粉管通道法）

法。為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。第19頁(yè)/共24頁(yè)要用方法從個(gè)體水平由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用的技術(shù)是

植物組織培養(yǎng)

，該技術(shù)的核心是

脫分化（去分化。）和再分化為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的

耐鹽基因（目的基因）

作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，又一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。鑒定水稻植株的耐鹽性。第20頁(yè)/共24頁(yè)科學(xué)家從預(yù)期人的生長(zhǎng)激素的功能出發(fā)，推測(cè)相應(yīng)的脫氧核苷酸序列，并人工合成了雙鏈DNA片段，獲得雙鏈DNA。將人的生長(zhǎng)激素基因與大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行重組，并成功地在大腸桿菌中得以表達(dá)。已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—據(jù)圖回答：第21頁(yè)/共24頁(yè)、目的基因、終止子以及(1)建構(gòu)基因表達(dá)載體時(shí)，必須有

標(biāo)記基因

啟動(dòng)子

。（2）為精確獲取圖中的目的基因，所用的限制酶是限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ。例題分析(3)將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)菌B之前，要將細(xì)菌B放入一定濃度的CaCl2溶液中處理，使之成為感受態(tài)的細(xì)菌。人的基因之所以能與大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行重組并發(fā)揮其功能，是因?yàn)槎叩目臻g結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。(4)人體的生長(zhǎng)激素基因能在細(xì)菌體內(nèi)成功表達(dá)是因?yàn)?共用一套（遺傳）密碼子。(5)將得到的大腸桿菌B涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長(zhǎng)的，說(shuō)明已導(dǎo)入了

質(zhì)粒或重組質(zhì)粒，反之則沒有導(dǎo)入。(6)上述制備人的生長(zhǎng)激素，運(yùn)用的現(xiàn)代生物工程技術(shù)是

蛋白質(zhì)工程

。第22頁(yè)/共24頁(yè)例題分析④綠色熒光蛋白基因⑧豬胎兒成纖維細(xì)胞Ti質(zhì)粒重組質(zhì)粒水母②③⑦豬卵母細(xì)胞細(xì)胞核細(xì)胞核⑥①受體母豬

早期胚胎 重組細(xì)胞綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬妊娠分娩⑤去核卵母細(xì)胞第23頁(yè)/共24頁(yè)我國(guó)首例綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的種豬場(chǎng)自然分娩產(chǎn)出，這標(biāo)志著我國(guó)在轉(zhuǎn)基因克隆豬技術(shù)領(lǐng)域已達(dá)到世界領(lǐng)先水平。下圖為我國(guó)首例綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬的培育過(guò)程示意圖，請(qǐng)據(jù)圖回答：過(guò)程①必需用到