多位點復(fù)合擴增STR技術(shù)在兩例人源腫瘤細(xì)胞系身份鑒定中的應(yīng)用

多位點復(fù)合擴增STR技術(shù)在兩例人源腫瘤細(xì)胞系身份鑒定中的應(yīng)用

Summary目的：提取兩株人源細(xì)胞腫瘤細(xì)胞CNE-1和CNE-2的基因組DNA，采用多位點復(fù)合擴增STR技術(shù)對20個常染色體STR基因座和一個性別決定基因座AMEL進行復(fù)合擴增，毛細(xì)管電泳后分析兩例細(xì)胞株的STR型別，使用DSMZ和Cellosurus的STR在線比對數(shù)據(jù)庫進行STR比對，鑒別細(xì)胞系的身份。實驗結(jié)果表明CNE-1和CNE-2彼此之間的匹配率為98.63%；使用DSMZ數(shù)據(jù)庫和Cellosurus對CNE-1和CNE-2細(xì)胞系STR比對結(jié)果表明它們與HeLa的匹配率分別為91.7%/94.4%和94.44%/95.77%。結(jié)論：經(jīng)STR分型技術(shù)鑒定，CNE-1和CNE-2細(xì)胞系為同一來源，且與HeLa的STR分型圖譜具有高度相似性，說明這兩株細(xì)胞系已經(jīng)被HeLa細(xì)胞污染。Keys：人源細(xì)胞株，細(xì)胞身份鑒定，STR技術(shù)細(xì)胞系作為一種重要的生物模型廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中，選擇身份正確的細(xì)胞系模型是確保研究結(jié)果真實可靠的前提[1,2]。本研究中，我們通過21位點STR分型技術(shù)對本實驗室保存的兩株人腫瘤細(xì)胞系CNE-1和CNE-2進行身份鑒定，發(fā)現(xiàn)這兩株細(xì)胞系已經(jīng)被HeLa細(xì)胞污染。我們建議其他實驗室在使用CNE-1和CNE-2細(xì)胞系進行實驗研究前對其進行身份認(rèn)證，以免使用錯誤細(xì)胞系進行研究導(dǎo)致實驗結(jié)果的可靠性受到影響。1材料與方法1.1材料實驗儀器與試劑臺式低速離心機；臺式冷凍離心機；細(xì)胞培養(yǎng)箱；恒溫水浴鍋；旋渦振蕩儀；倒置顯微鏡；超凈工作臺；純水儀；基因擴增儀；ABI3100遺傳分析儀。DMEM培養(yǎng)基、EDTA-胰酶消化液、PBS緩沖溶液等均購自索萊寶；胎牛血清購自BiologicalIndustries。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)從-80℃冰箱中取出凍存的CNE-1和CNE-2細(xì)胞，復(fù)蘇到一個T25培養(yǎng)瓶后，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時棄掉舊完全培養(yǎng)基后用PBS洗滌，加入1mL胰蛋白酶-EDTA消化液進行消化，加入2mL完全培養(yǎng)基終止消化，1,000rpm離心3分鐘后收集細(xì)胞沉淀。1.2.2基因組DNA的提取和STR擴增及分析提取細(xì)胞系基因組DNA并采用STR多重擴增技術(shù)對D19S433、D5S818、D13S317、AMEL等共21個STR基因座位點進行PCR擴增反應(yīng)。將細(xì)胞系外檢，基因組DNA提取和STR多重擴增按照試劑盒說明書進行。PCR擴增反應(yīng)體系：2×PCR反應(yīng)混合液、0.2μM反應(yīng)引物、1μL待測細(xì)胞系基因組DNA、陰性對照（ddH2O）進行PCR擴增，反應(yīng)體系總體積為25μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，60℃退火30秒，70℃延伸60秒，共30個循環(huán)；60℃延伸30分鐘；4℃保存。PCR擴增結(jié)束后，加入去離子甲酰胺和內(nèi)標(biāo)后取1μL的PCR擴增產(chǎn)物于ABI3100遺傳分析儀進行高分子聚合物凝膠電泳并掃描電泳結(jié)果，將CNE-1和CNE-2相互比對并分別在DSMZ和Cellosurus在線STR比對數(shù)據(jù)庫進行17位點和20位點STR比對，使用Tanabe公式，即，匹配率=（2×共同峰數(shù)）/（參考峰數(shù)+待檢峰數(shù)）×100%。2結(jié)果2.1CNE-1和CNE-2的STR分型圖譜CNE-1和CNE-2的STR位點信息如圖1所示，兩者的21個STR位點中只有D18S51位點有一個等位基因不同，其余位點均相同，彼此之間的匹配率為98.63%。根據(jù)STR匹配閾值可判斷CNE-1和CNE-2細(xì)胞系具有相同來源。然而CNE-1是從高分化鱗癌女性患者分離的細(xì)胞株，而CNE-2是從低分化鱗癌男性患者分離的細(xì)胞株，兩者的供體來源不同，其STR圖譜不應(yīng)該會表現(xiàn)出如此高度一致性，可能是這兩株細(xì)胞系發(fā)生了相同的交叉污染。圖1：CNE-1細(xì)胞系（左）和CNE-2（右）的STR分型圖譜2.2DSMZ在線STR比對我們通過DSMZ在線STR數(shù)據(jù)庫將CNE-1和CNE-2與細(xì)胞庫內(nèi)的參考細(xì)胞系進行17位點STR比對，從而進行身份鑒定。CNE-1比對結(jié)果如圖2（CNE-2采用相同方法比對），紅色方框框出來的為參考細(xì)胞系，結(jié)果證實CNE-1和CNE-2分別與HeLa細(xì)胞系的匹配率為91.7%和94.4%，說明這兩株細(xì)胞系為HeLa細(xì)胞系的替代物。

圖2：CNE-1與DSMZ細(xì)胞庫內(nèi)參考細(xì)胞系的STR比對結(jié)果2.3Cellosurus在線STR比對Cellosurus在線STR數(shù)據(jù)庫中可提供包括CSF1PO、D2S1338、D3S1358、D5S818、AMEL等在內(nèi)的最多32個位點的STR圖譜。本研究中檢測的21個STR位點均包括在這32個位點中。如圖3所示，CNE-1分型與Cellosurus庫內(nèi)STR數(shù)據(jù)比對（CNE-2采用相同方式比對），比對結(jié)果表明CNE-1和CNE-2與HeLa細(xì)胞的STR匹配率分別為94.44%和95.77%，證實CNE-1和CNE-2為HeLa細(xì)胞污染物。圖3：CNE-1與Cellosurus數(shù)據(jù)庫內(nèi)參考細(xì)胞系的STR比對結(jié)果3討論細(xì)胞系的交叉污染是指一個細(xì)胞系被另外一個細(xì)胞系取代的過程，常常由于不規(guī)范的實驗室操作，比如同時使用兩個及以上細(xì)胞系、不同細(xì)胞系共用培養(yǎng)基、移液管等試劑耗材導(dǎo)致。鼻咽癌高發(fā)于我國南部和東南亞地區(qū)，我國研究者常常使用體外培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞系進行鼻咽癌相關(guān)病理機制及抗癌藥物療效研究。有文獻(xiàn)報道CNE-1和CNE-2細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞系雜交污染[3]。為了驗證本課題組保存的兩株鼻咽癌細(xì)胞系的身份，本研究使用STR鑒定技術(shù)進行了檢測，實驗結(jié)果證實這兩株細(xì)胞系并非先前報道的HeLa雜交污染物，而是完全的HeLa替代物。細(xì)胞系交叉污染是全球面臨的一個長期且嚴(yán)峻問題，研究者和細(xì)胞庫做好細(xì)胞系的質(zhì)量控制和交叉污染檢查外，期刊雜志和資助機構(gòu)等對細(xì)胞系交叉污染問題的學(xué)術(shù)規(guī)范也非常重要，只有施行全面的細(xì)胞系交叉污染防范和質(zhì)量管理措施，才能夠高效地推進全球根本解決細(xì)胞系質(zhì)量問題。Reference1.SourenNY,FusenigNE,HeckS,DirksWG,Capes-DavisA,BianchiniF,PlassC:Celllineauthentication:anecessityforreproduciblebiomedicalresearch.Emboj2022,41(14):e111307.2.RojasA,GonzalezI:Celllinecross-contamination:adetrimentalissueincurrentbiomedicalresearch.CellBiolInt2018,42(3):272.3.ChanSY,Cho