生物技術(shù)-基因工程原理課件 第十章 點突變的檢查方法

第十章

點突變的檢查方法基因突變的檢測方法目前幾乎所有的基因突變檢測的分子診斷技術(shù)都是建立在PCR的基礎(chǔ)上，由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，自動化程度越來越高，分析時間大大縮短，分析結(jié)果的準確性也有了很大提高。PCR-SSCP法單鏈構(gòu)像多態(tài)性

(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)基本原理：單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成，在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其堿基序列不同而形成不同構(gòu)象，一個堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上移動速度改變，不同的二級結(jié)構(gòu)而出現(xiàn)不同的遷移象。該法不能測定突變的準確位點，還需通過序列分析來確定。對于大于200bp的片段，用其DNA分子來做SSCP會提高其靈敏度。該法簡單快速，被廣泛用于未知基因突變的檢測。由于該法的簡便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。雜合雙鏈分析法(heterodulexanalgsis,HA)直接在非變性凝膠上分離雜交的突變型-野生型DNA雙鏈。由于突變型和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應(yīng)同源雙鏈DNA不同的遷移率。HA對一些不能用SSCP檢出的突變有互補作用，二者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高近100%。突變體富集PCR

(mutant-enrichedPCR)利用癌基因或抑癌基因某個編碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點，用連續(xù)二次的巢式PCR來擴增包括存在酶位點編碼子的DNA片段，在兩次擴增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進入第二次PCR擴增并得到產(chǎn)物的富集。變性梯度凝膠電泳法

(denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)雙鏈DNA在變性梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳，凝膠中自上而下所含變性劑濃度線性增長，DNA片段進行到變性劑某一濃度，與DNA變性溫度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，但解鏈的DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同時間解鏈，則因影響電泳速度變化的程度而被分離。在DGGE基礎(chǔ)上，又發(fā)展了用溫度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGE法(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)。由于DGGE和TGGE是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，均需專用的電泳裝置?；瘜W(xué)切割錯配法(Chemicalcleavageofmismatch，CCM)基本原理：將待測含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或RNA片段混合變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯配的C能被羥胺或哌啶切割，錯配的T能被四氧化鋨切割，經(jīng)變性凝膠電泳可確定是否存在突變。

等位基因特異性寡核苷酸分析法

(allele-specificoligonucleotideASO)設(shè)計一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR擴增的樣