WesternBlot詳解和問題分析專家講座

蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及常見問題分析張紹進(jìn)WesternBlot詳解和問題分析專家講座第1頁WesternBlot介紹WesternBlot普通流程WesternBlot常見問題分析WesternBlot詳解和問題分析專家講座第2頁WesternBlot介紹：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用對(duì)應(yīng)探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品一個(gè)方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定DNA片段方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后蛋白質(zhì)分子印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子印跡分析稱為Eastern印跡法。WesternBlot詳解和問題分析專家講座第3頁WesternBlot基本原理WesternBlot詳解和問題分析專家講座第4頁WesternBlot優(yōu)點(diǎn)

高分辨率電泳技術(shù)特異敏感抗原-抗體反應(yīng)1-5ng中等大小靶蛋白WesternBlot詳解和問題分析專家講座第5頁WesternBlot應(yīng)用目標(biāo)蛋白表示特征分析目標(biāo)蛋白與其它蛋白互作目標(biāo)蛋白組織定位目標(biāo)蛋白表示量分析WesternBlot詳解和問題分析專家講座第6頁WesternBlot流程蛋白樣品制備SDS轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色WesternBlot詳解和問題分析專家講座第7頁經(jīng)過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最慣用溶劑。有機(jī)溶劑提取法對(duì)于分子中非極性側(cè)鏈較多蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包含乙醇、丙酮和丁醇等。經(jīng)過層析或電洗脫法制備目標(biāo)蛋白蛋白樣品提取WesternBlot詳解和問題分析專家講座第8頁蛋白樣品定量當(dāng)前慣用比色法測(cè)定樣品蛋白含量：Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、BCA法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn)，大家能夠依據(jù)詳細(xì)情況選取。按對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測(cè)定樣品濃度。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定各種方法匯總：/thread-23639-1-1.htmlWesternBlot詳解和問題分析專家講座第9頁蛋白樣品變性2×SDS上樣緩沖液：DTT可臨用前以1：4百分比混合加入，亦可全部配好分裝，-20℃凍存。按1:1百分比與蛋白質(zhì)樣品混合，95～100℃加熱5～15min，冰上冷卻后再上樣，上樣量普通為20-25μl，總蛋白量20～50μg。1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚藍(lán)0.2g總體積100ml100mMTris-HCl(pH6.8)200mMDTT4%SDS0.2%溴酚蘭20%甘油ddH2OWesternBlot詳解和問題分析專家講座第10頁SDS：陰離子去污劑變性劑氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶負(fù)電荷大大超出了蛋白質(zhì)分子原有電荷量，消除了不同分子之間原有電荷差異。與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。WesternBlot詳解和問題分析專家講座第11頁蛋白質(zhì)-SDS膠束特點(diǎn)：（1）含有相同形狀，形狀像一個(gè)長橢圓棒

（2）平均1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS（3）短軸對(duì)不一樣蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同（4）長軸長度則與亞基分子量大小成正比WesternBlot詳解和問題分析專家講座第12頁不連續(xù)電泳緩沖體系。SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量大小。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳W(wǎng)esternBlot詳解和問題分析專家講座第13頁SDS

是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇樣品處理液，SDS是一個(gè)很強(qiáng)陰離子表面活性劑，它能夠斷開分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）能夠斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有凈電荷，從而消除了不一樣種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷差異。蛋白質(zhì)電泳遷移率主要決定于亞基相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷性質(zhì)無關(guān)?！維DS基本原理】WesternBlot詳解和問題分析專家講座第14頁凝膠成份丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺SDS配膠Tris緩沖液TEMED過硫酸銨Tris-甘氨酸電泳緩沖液WesternBlot詳解和問題分析專家講座第15頁P(yáng)AGE：聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠?；瘜W(xué)惰性強(qiáng)，含有一定機(jī)械強(qiáng)度和透明度。是良好電泳介質(zhì)。WesternBlot詳解和問題分析專家講座第16頁聚丙烯酰胺凝膠聚合方式：單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；催化劑：過硫酸胺或核黃素（AP）；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是經(jīng)過提供氧游離基(freeradicals)催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redoxsystems)來完成。催化體系主要有化學(xué)催化（AP—TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素——TMTED）體系。WesternBlot詳解和問題分析專家講座第17頁凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS濃縮膠(5%Acrylamide)及分離膠配方表：/thread-20726-1-1.html

WesternBlot詳解和問題分析專家講座第18頁不連續(xù)電泳：

作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，依據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：pH8.3Tris-甘氨酸系統(tǒng)。WesternBlot詳解和問題分析專家講座第19頁灌制分離膠隔絕空氣ddH2O0.1%SDS:<8%異丁醇：>8%WesternBlot詳解和問題分析專家講座第20頁灌制積層膠插入梳子WesternBlot詳解和問題分析專家講座第21頁StakinggelSeparatinggelWesternBlot詳解和問題分析專家講座第22頁轉(zhuǎn)膜要將電泳后分離蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（比如NC膜）上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。慣用電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。二者原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場機(jī)械裝置不一樣。WesternBlot詳解和問題分析專家講座第23頁轉(zhuǎn)移膜選擇最慣用于WesternBlot轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，另外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和NC膜特點(diǎn)相同,主要用于核酸雜交。各種膜詳細(xì)特點(diǎn)介紹：/bio101//21461_2.htmWesternBlot詳解和問題分析專家講座第24頁濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)WesternBlot詳解和問題分析專家講座第25頁半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)WesternBlot詳解和問題分析專家講座第26頁麗春紅染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色

只用于放射性標(biāo)識(shí)抗體或放射性標(biāo)識(shí)A蛋白探針Western印跡過程。轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)（此步能夠省略）WesternBlot詳解和問題分析專家講座第27頁封閉為防止作為檢測(cè)試劑特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提升，需對(duì)膜上潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。5%脫脂奶粉或BSA（室溫孵育1h）WesternBlot膜封閉液（生物試劑企業(yè)）Tween-20作用：降低非特異性吸附，不影響抗體與抗原結(jié)合。WesternBlot詳解和問題分析專家講座第28頁一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，依據(jù)膜面積以0.1mL/cm2量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封閉液配制二抗，搖床上遲緩搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過夜?；厥找豢谷芤?，用TBST漂洗膜3次，每次10min。最終用TBS漂洗膜2次，每次10min。WesternBlot詳解和問題分析專家講座第29頁二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)WesternBlot詳解和問題分析專家講座第30頁膜解吸方法（膜重復(fù)利用）

經(jīng)過加熱和去污劑進(jìn)行解吸

原理：組合使用去污劑和加熱使抗體解離，適合用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。酸解吸

原理：使用低pH改變抗體結(jié)構(gòu)從而使結(jié)合位點(diǎn)失活，從而將抗體與抗原分離，適合用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。WesternBlot詳解和問題分析專家講座第31頁WesternBlot結(jié)果分析目標(biāo)蛋白灰度值除以內(nèi)參灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品目標(biāo)蛋白相對(duì)含量。WesternBlot結(jié)果分析軟件Gel-ProAnalyzer4綠色版（附動(dòng)畫演示教程）/thread-44929-1-1.html

WesternBlot詳解和問題分析專家講座第32頁WesternBlot常見問題分析WesternBlot詳解和問題分析專家講座第33頁SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷潔凈加入AP和TEMED量要適當(dāng)加入試劑后搖勻，使其充分混合，預(yù)防部分膠塊聚合不均勻溫度適當(dāng)，受熱不均勻造成膠聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對(duì)齊WesternBlot詳解和問題分析專家講座第34頁條帶比正常窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡可能混合均勻，動(dòng)作輕緩拔梳子要快速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會(huì)擠壓其它條帶造成寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否適當(dāng)SDS電泳W(wǎng)esternBlot詳解和問題分析專家講座第35頁轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè)凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長久使用造成海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊造成?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通草紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫WesternBlot詳解和問題分析專家講座第36頁轉(zhuǎn)移到膜上蛋白極少蛋白分子量<

10KD蛋白等電點(diǎn)<9SDS濃度不適當(dāng)凝膠太厚

原因?qū)Σ叩鞍追肿恿?lt;10KD時(shí)，降低轉(zhuǎn)膜時(shí)間；使用小孔徑膜更換高pH值Buffer在陰極buffer中加入0.005-0.01%SDS可提升轉(zhuǎn)膜效率延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間WesternBlot詳解和問題分析專家講座第37頁膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過高

原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測(cè)一抗、二抗工作濃度背景太高WesternBlot詳解和問題分析專家講座第38頁雜交信號(hào)很弱抗體保留不妥抗原不充分膜漂洗過分

原因?qū)Σ呖贵w長久保留應(yīng)在－70℃，使用前做效價(jià)檢測(cè)增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白對(duì)照降低漂洗時(shí)間和次數(shù)WesternBlot詳解和問題分析專家講座第39頁一抗不是唯一特異二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合

原因?qū)Σ咧苽鋯慰寺】贵w或者重新選取合成抗原多肽位點(diǎn)設(shè)置不加一抗，只加二抗平行對(duì)照來檢測(cè)二抗是否