膠原蛋白的制備與鑒定

膠原蛋白的制備與鑒定第1頁/共26頁膠原蛋白的提取與鑒定第2頁/共26頁一、引言二、膠原蛋白的提取三、膠原蛋白的鑒定四、結(jié)束語第3頁/共26頁一、引言膠原是生皮中最主要的纖維蛋白，是動(dòng)物皮膚的主要成分。除此之外，動(dòng)物的骨、齒、肌腱、韌帶、軟骨、血管等組織中都存在膠原。膠原是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%~30%，在真皮蛋白質(zhì)中，膠原占85%~90%。第4頁/共26頁隨著時(shí)代和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)谔接懩z原的化學(xué)、物理、生物學(xué)性質(zhì)的過程中，逐漸認(rèn)識(shí)和開辟著膠原廣泛應(yīng)用的新領(lǐng)域．以求開發(fā)具有高附加值的膠原新產(chǎn)品尤其是當(dāng)人們認(rèn)識(shí)到膠原具有其它高分子材料無可比擬的弱的抗原性、生物相容性和生物降解性時(shí)，人們更意識(shí)到膠原作為生物材料在醫(yī)藥、儀器、化妝品、飼料肥料等工業(yè)中的重要性。第5頁/共26頁動(dòng)物皮的水解產(chǎn)物利用通過酸、堿、酶的作用對(duì)動(dòng)物皮進(jìn)行水解，可以得到不同分子質(zhì)量的產(chǎn)物，包括膠原、明膠、水溶性明膠、多肽、短肽和氨基酸。對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行恰當(dāng)?shù)姆蛛x，得到所要的產(chǎn)物。一般有以下用途：1、可注射膠原2、止血膠原海綿、敷料3、手術(shù)縫線與醫(yī)用纖維??????第6頁/共26頁二、提取2.1、膠原蛋白的結(jié)構(gòu)A—電鏡下膠原纖維呈明暗交替的條紋圖案；B—膠原纖維中原膠原分子的排列；C—原膠原分子是一種右手三股螺旋；D—三股螺旋中的每股鏈?zhǔn)亲笫致菪?；E—三股螺旋的原膠原分子水平模型第7頁/共26頁膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)單元是原膠原。原膠原為細(xì)長(zhǎng)的棒狀分子，由三條肽鏈構(gòu)成。每條肽鏈由1000個(gè)以上的氨基酸殘基構(gòu)成，不含色氨酸，其中脯氨酸是膠原特有的氨基酸。膠原蛋白中甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸含量高，不能形成α螺旋或β折疊片結(jié)構(gòu)，而是形成以三條稱為α肽鏈或α鏈的多肽鏈（亞基）纏繞成特有的三股螺旋。雖然各種類型的膠原蛋白都具有相似的螺旋結(jié)構(gòu)特征，但組成膠原蛋白的各α多肽鏈的結(jié)構(gòu)有很大的差別。第8頁/共26頁以Ⅰ型膠原為例，其一級(jí)結(jié)構(gòu)，膠原中含有較為伸展的左手螺旋區(qū)段以及非螺旋區(qū)段，在螺旋區(qū)段中則呈現(xiàn)出了（Gly-X-Y）n（其中X，Y代表非甘氨酸）的周期性排列。二級(jí)結(jié)構(gòu)則由三條呈左手螺旋的肽鏈形成的右手大螺旋（如右圖所示）。三股螺旋分子間以一定間距、呈縱向?qū)ΨQ交錯(cuò)排列形成原纖維，再聚集成纖維，然后形成更大的纖維束。第9頁/共26頁2.2、膠原蛋白的提取提取一般由下列步驟組成：萃取、分離、提純2.2.1、萃取萃取具體操作方式和控制條件因皮源的不同而有所差異。以下是幾種常用的方法:酸法提取堿法提取酶法提取此外，還有酸酶結(jié)合法、酸堿結(jié)合法、酸堿與熱水結(jié)合法等。第10頁/共26頁（1）酸法提取主要影響因素例證原理及常用材料酸法提取是用酸浸泡預(yù)處理后的材料，再經(jīng)離心等操作提純的提取方法。常用的酸有：乙酸、鹽酸、草酸、檸檬酸、醋酸以及乳酸等.在影響酸法提取的諸多因素中，pH的影響不大，但pH值過小膠原大分子帶正電荷，因電荷之間的排斥作用使膠原不能形成穩(wěn)定的凝膠；動(dòng)物皮的種類以及對(duì)皮的預(yù)處理也是重要影響因素之一；酸的種類和濃度、以及提取溫度和時(shí)間影響都較大。一般情況下，提取率隨溫度升高、時(shí)間延長(zhǎng)而提高，但時(shí)間過長(zhǎng)或溫度過高導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致膠原變性從而使提取率降低。.1葉易春等通過對(duì)酸法提取豬皮膠原分析得出：酸法提取時(shí)，提取時(shí)間不同，其相對(duì)分子量及分布基本相同2戶業(yè)麗等以酸法提取鱘魚皮膠原蛋白，通過正交試驗(yàn)得出：乳酸較乙酸、檸檬酸提取率高；隨著乳酸濃度的增加，膠原蛋白的提取率也隨之增加，但當(dāng)濃度超過1mol/L后，由于膠原蛋白變性導(dǎo)致提取率下降；在一定范圍內(nèi)浸提時(shí)間越長(zhǎng)，膠原提取率增加越快，而后趨于平穩(wěn)，最后還有可能會(huì)降低。其實(shí)驗(yàn)得出對(duì)膠原提取率的影響程度：酸濃度＞提取時(shí)間＞溫度＞固液比。第11頁/共26頁采用該法能有效胡提高提取率，但只能得到相對(duì)分子量較小的膠原蛋白水解產(chǎn)物，應(yīng)用價(jià)值并不太高。與其他提取法相似，提取時(shí)間的延長(zhǎng)在一定范圍內(nèi)可以使提取率增加。用堿溶解預(yù)處理后的材料，從而達(dá)到提取膠原蛋白的目的。預(yù)處理時(shí)除去皮中的脂肪、污漬、雜質(zhì)等越好，就越有利于膠原蛋白的提取。已經(jīng)有人以堿法提取皮革廢棄物中的膠原蛋白，其中最關(guān)鍵的是脫鉻。影響堿法提取的因素主要有堿濃度、提取溫度、預(yù)處理、pH以及時(shí)間。一定范圍內(nèi)提高堿濃度有利于提高膠原蛋白提取率。一定范圍內(nèi)提高溫度，有利于水解得到相對(duì)分子量較小的膠原產(chǎn)物，但超過范圍會(huì)導(dǎo)致膠原的生物活性喪失。

（2）堿法提取原理優(yōu)劣勢(shì)影響因素第12頁/共26頁（3）酶法提取原理發(fā)展預(yù)處理主要因素工藝特點(diǎn)酶法提取是在預(yù)處理后的材料中加入酶制劑，溶解材料，再經(jīng)過其他操作提取膠原蛋白。

目前國(guó)內(nèi)采用酶法提取膠原時(shí)的水解溫度基本在50℃以上或4℃以下，而膠原在37~38℃以上就會(huì)變性，生成明膠，故較高溫度下的提取物為變性膠原，其進(jìn)一步應(yīng)用受到限制[13]。低溫下雖然有助于膠原結(jié)構(gòu)的完整，但酶解時(shí)間長(zhǎng)。預(yù)處理是除去皮源中的不同雜物，如鈣物質(zhì)、脂肪等，以便后續(xù)操作，得到更多更純的膠原。李國(guó)英等在通過優(yōu)化預(yù)處理來提取膠原的研究中指出：對(duì)比而言，預(yù)處理主要集中在去鈣上，因?yàn)槟切o機(jī)物質(zhì)中最主要的成分是鈣，鈣會(huì)降低胃蛋白酶活性從而影響膠原提取率。可見預(yù)處理對(duì)于膠原提取率的影響較大。影響因素主要有酶的用量、水解pH、水解時(shí)間、以及水解溫度。工藝為：預(yù)處理→酶解→鹽析→透析→冷凍干燥。用酶解法提取膠原蛋白是目前比較理想的手段，它具有反應(yīng)快、時(shí)間短、對(duì)環(huán)境友好，提取膠原蛋白純度高、水溶性好、理化性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)第13頁/共26頁（4）影響因素分析皮源預(yù)處理情況提取液濃度pH提取溫度提取時(shí)間有的還有提取液固液比、提取工藝等第14頁/共26頁2.2.2、分離分離是對(duì)提取得得膠原溶液中各類膠原進(jìn)行初步分級(jí)（1）鹽析分級(jí)

鹽析分級(jí)是常用的分離方法：恰當(dāng)?shù)乜刂迫芤旱柠}濃度，使特定的膠原析出。（2）熱膠化分離

利用不同類型的膠原可膠化性的差異，使得部分膠原被膠化而與其他膠原分離的方法。（3）變形和復(fù)性分離

已知含雙硫鍵的分子在變性后的復(fù)性要比不含雙硫鍵的快的多。I型與II型膠原的分離，可以利用這一性質(zhì)。第15頁/共26頁2.2.3、提純

經(jīng)過提取和分離得到的膠原樣品仍在不同程度上含有其他類型的膠原，此外，還攜帶有某些類粘蛋白、球蛋白雜質(zhì)，需經(jīng)過進(jìn)一步提純。膠原蛋白的提純主要使用層析方法，如離子交換層析和凝膠過濾層析等。第16頁/共26頁三、膠原蛋白的鑒定1、膠原蛋白的定量 蛋白質(zhì)的定量是研究蛋白質(zhì)的基本步驟，定量研究的數(shù)據(jù)是其它進(jìn)一步研究的基礎(chǔ),定量測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度的方法很多,有凱氏定氮法雙縮脲法、福林酚法和紫外光吸收法、考馬斯亮藍(lán)法、氨基酸分析法。第17頁/共26頁膠原蛋白的定量分析凱氏定氮法??????雙縮脲法考馬斯亮藍(lán)G250法福林酚法第18頁/共26頁雖有普遍性,但操作繁瑣費(fèi)時(shí)將一定量的蛋白質(zhì)用濃硫酸消化分解使其中的氮變成銨鹽變氮為氨與濃NaOH作用使氨氣釋放出后硼酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收再用標(biāo)準(zhǔn)酸直接滴定．或用標(biāo)準(zhǔn)酸液吸收氨氣后用反滴定法滴定殘留的酸吸收氨條件求得該蛋白質(zhì)樣品中的含氮量．再通過換算得知樣品中的蛋白質(zhì)含量計(jì)算凱氏定氮法測(cè)量氨的含量轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)中的氮計(jì)算蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量(約14％～16％),第19頁/共26頁

光吸收法由于蛋白質(zhì)含有芳香族氨基如色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tgr)，故在280nm有吸收最大峰。用280nm光吸收值可定量測(cè)定該種蛋白質(zhì)的量，但是每種蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸含量不同，故采用280nm光吸收為1時(shí)，吸光度等于1mg/mI來計(jì)算另由于核酸類雜質(zhì)在280nm也有光吸收為了排除其擾．采用280nm和260nm光吸收值用下式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度(mg/mI)=145A～074A。最難確定的方法是用蛋白質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)計(jì)算精確稱取1mg～10mg已恒重過的純蛋白的樣品.配成1mg／mI濃度的樣品．測(cè)其在280nm下的光吸收值可得出該蛋白質(zhì)的克分子消光系數(shù)光吸收法，測(cè)定迅速用量少不消耗樣品故被廣泛采用．但必須注意該法僅適用于純蛋白樣品。第20頁/共26頁其他方法雙縮脲法該方法的原理是基于膠原蛋白質(zhì)分子中的肽鍵CONH在堿性溶液中與cu絡(luò)合呈藍(lán)色的雙縮脲反應(yīng)。該方法受蛋白質(zhì)的特異性影響較小．適用于較大量膠原蛋白質(zhì)(毫克級(jí))的定量測(cè)定。福林酚法優(yōu)點(diǎn):靈敏度高,重復(fù)性好.顏色深,析光度大.缺點(diǎn):試劑配制麻煩.盡管該法靈敏度和準(zhǔn)確度都較高，但操作較繁瑣并且影響因素較多而受到局限考馬斯亮藍(lán)G250法該方法適合于定量測(cè)定范圍是10mg～100mg操作簡(jiǎn)單．應(yīng)用廣泛第21頁/共26頁2、蛋白質(zhì)的純度鑒定蛋白質(zhì)的純度質(zhì)譜

氨基酸定量分析

分析電泳等電點(diǎn)第22頁/共26頁等電點(diǎn)一種蛋白質(zhì)只有一個(gè)等電點(diǎn)測(cè)定等電點(diǎn)的具體方法有所不同，即使同一種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)也會(huì)不同．故應(yīng)是在同一種測(cè)定方法下進(jìn)行比較對(duì)某些產(chǎn)品的純度鑒定時(shí)，雖然用某些方法證明是純的．但在等電點(diǎn)聚集分析時(shí)出現(xiàn)較多的條帶．

等電點(diǎn)聚集法可以測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)同時(shí)又能鑒定蛋白質(zhì)的純度

第23頁/共26頁1和標(biāo)樣的氨基酸組成相比較以確認(rèn)樣品的氨基酸組成是與和標(biāo)樣的氨基酸組成一樣氨基酸定量分析

2如果是種未知蛋白質(zhì)則到其數(shù)據(jù)庫(Protcndatabank)去查閱比較是否與已知蛋白質(zhì)的氨基酸組成相似以確定樣品是否是一種的蛋白質(zhì)氨基酸第24頁/共26頁四、結(jié)束