細(xì)胞生物學(xué)研究方法課件

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗(yàn)證的假說(shuō)設(shè)計(jì)對(duì)照試驗(yàn)收集資料作出合理結(jié)論生物學(xué)研究模式生物不同物種享有共同分子機(jī)制如何學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)？抽象思維與動(dòng)態(tài)觀點(diǎn)結(jié)構(gòu)與功能統(tǒng)一的觀點(diǎn)同一性(unity)和多樣性(diversity)的問(wèn)題細(xì)胞生物學(xué)的主要內(nèi)容：結(jié)構(gòu)與功能（動(dòng)態(tài)特征）；細(xì)胞的生命活動(dòng)；實(shí)驗(yàn)科學(xué)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)——細(xì)胞真知源于實(shí)驗(yàn)室——Whatweknow//Howweknow.第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)

用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

離心分離技術(shù)

細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)

細(xì)胞的培養(yǎng)

細(xì)胞工程一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)

普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

倒置顯微鏡

熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

微分干涉顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）

錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）三、掃描遂道顯微鏡ScanningProbeMicroscope,SPM(80年代發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器)包括：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí)，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計(jì)算機(jī)顯示出來(lái)，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。特點(diǎn)：（1）可對(duì)晶體或非晶體成像，無(wú)需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.01nm）； （2）可實(shí)時(shí)得到樣品表面三維圖象，可測(cè)量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測(cè)量； （4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

光鏡樣本制作分辨率是指區(qū)分開(kāi)兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離λ:光源波長(zhǎng)N:介質(zhì)折射率α:物鏡鏡口角(標(biāo)本在光軸的一點(diǎn)對(duì)物鏡鏡口的張角)通常:

α最大值可達(dá)1400，空氣中N=1，最短的可見(jiàn)光波長(zhǎng)λ為450nm，此時(shí)D=292nm，約0.3μm。在油鏡下，N可提高到1.5，此時(shí)D可達(dá)0.2μm。激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理共焦點(diǎn)：物鏡與聚光鏡同時(shí)聚焦到同一個(gè)小點(diǎn)，即它們互相共焦點(diǎn)。應(yīng)用： 排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng) 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細(xì)胞。微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）

計(jì)算機(jī)輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見(jiàn)光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差電子顯微鏡的基本構(gòu)造主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）與金屬投影 染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。 冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）（技術(shù)示意圖） 冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來(lái)觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quickfreezedeepetching）電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）——主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。掃描電鏡原理與應(yīng)用：電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成象。CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問(wèn)題二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些 特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

FeulgenStaining三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限（圖）*蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)

免疫電鏡技術(shù)：免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過(guò)對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。五、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。步驟：前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）———放射自顯影六．定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜的吸收，測(cè)定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括：

紫外光顯微分光光度測(cè)定法可見(jiàn)光顯微分光光度測(cè)定法

流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量； 從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸

細(xì)胞生命活動(dòng)突變體分析突變體分析蛋白修飾分析基因表達(dá)多肽定性分析生物信息學(xué)序列測(cè)定雙向電泳分析DNA分離與克隆機(jī)器人技術(shù)(robotics)

功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)分離與制備蛋白質(zhì)組學(xué)構(gòu)成①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機(jī)械裝置原理經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡放大成虛像。LightPathwayofMicroscopeLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC超薄切片厚度僅50nm左右，用超薄切片機(jī)（ultramicroto-me）制作。Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana體外培養(yǎng)的細(xì)胞正在分裂生長(zhǎng)的Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞系細(xì)胞系名稱細(xì)胞類型來(lái)源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞HenriettaLacks

BHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉(cāng)鼠PtKl上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國(guó)地鼠HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin1951原理包在鞘液中的細(xì)胞通過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)（flowcytometer）。同核體：相同基因型的細(xì)胞融合而成。異核體：不同基因型的細(xì)胞融合而成。自發(fā)融合：同種細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。誘發(fā)融合：異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。