核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座

生物信息學(xué)4/25/20231核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第1頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析4/25/20232核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第2頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析第一節(jié)、核酸序列分析一、向數(shù)據(jù)庫中提交核酸序列二、限制性酶切圖譜分析和引物設(shè)計4/25/20233核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第3頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析一、向數(shù)據(jù)庫中提交核酸序列1、提交網(wǎng)站歐洲：EMBLWebIn美國：GenBankBankIt和Sequin日本及亞太：DDBJSaKURA4/25/20234核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第4頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析2、提交內(nèi)容（1）DNA/RNA

序列性質(zhì):DNA,mRNA序列起源:必須是試驗起源,包含合成;序列含有生物學(xué)意義,不能人造序列準(zhǔn)確性:沒有錯誤，沒有污染4/25/20235核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第5頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析（2）生物體給每條統(tǒng)計以正確生物名稱，主要因為每個生物在進(jìn)行蛋白翻譯是采取遺傳密碼子不一樣，從而對同一核酸序列產(chǎn)生不一樣蛋白序列.（3）引用闡述該序列生物學(xué)意義相關(guān)文章（4）編碼序列（編碼序列特征，CDS等）基因命名CDS確定（5）僅提交蛋白質(zhì)序列SWISS-PROT是最好提交地方4/25/20236核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第6頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析3、向Genbank提交序列方式（1）利用BankIt網(wǎng)上提交（2）利用Sequin軟件提交4/25/20237核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第7頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析（1）在線提交核酸序列（BankIt）

BankIt是NCBI提供一個在線提交序列工具。由一系列表單，包含聯(lián)絡(luò)信息、公布要求、引用參考信息、序列起源信息以及序列本身信息等。用戶提交序列后，會從電子郵件收到自動生成數(shù)據(jù)條目，Genbank新序列編號，以及完成注釋后完整數(shù)據(jù)統(tǒng)計用戶還能夠在BankIt頁面下修改已公布序列信息。BankIt適合于獨立測序工作者提交少許序列，而不適合大量序列提交，也不適合提交很長序列，EST序列和GSS序列也不應(yīng)用BankIt提交。4/25/20238核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第8頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析在線提交序列過程1.登陸B(tài)ankIt頁面/BankIt2.填寫表單內(nèi)容。3.確認(rèn)表單內(nèi)容。4.等候電子郵件返回信息。4/25/20239核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第9頁生物信息學(xué)登陸B(tài)ankIt頁面（一）/genbank/第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析4/25/202310核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第10頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析登陸B(tài)ankIt頁面（二）4/25/202311核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第11頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析登陸B(tài)ankIt頁面（三）4/25/202312核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第12頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析注冊用戶名并登陸核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第13頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析填寫表單信息（一）聯(lián)絡(luò)人信息4/25/202314核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第14頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析填寫表單信息（二）序列作者相關(guān)文件信息4/25/202315核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第15頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析填寫表單信息（三）序列公開公布日期提交序列數(shù)目序列信息4/25/202316核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第16頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析填寫表單信息（四）4/25/202317核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第17頁生物信息學(xué)（2）利用Sequin軟件提交第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析怎樣使用？下載Sequin軟件/sequin/利用sequin軟件生成序列注冊文件以附件形式E-mail給NCBI.E-mail:gb-sub@什么情況下使用Sequin軟件？需要同時提交大量序列；或提交序列較長，注釋信息復(fù)雜；對序列進(jìn)行編輯和處理復(fù)雜注釋。4/25/202318核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第18頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析Sequin軟件介紹怎樣取得？核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第19頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析二、限制性酶切圖譜分析和引物設(shè)計1、限制性酶切圖譜分析1.1限制性內(nèi)切酶定義

生物體內(nèi)能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列并將其切斷酶，簡稱限制酶（Restrictionenzymes)。1.2限制性內(nèi)切酶識別序列與酶切特點特異性識別含有回文結(jié)構(gòu)序列，比如，EcoRI識別次序為：5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’識別序列長度普通為4~8個核苷酸，慣用為識別6個核苷酸限制酶。酶切后產(chǎn)生新末端結(jié)構(gòu)：5’端為磷酸基，3’端為羥基末端結(jié)構(gòu)分為三類：平端、5’端突起和3’端突起4/25/202320核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第20頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析1、限制性酶切圖譜粘性末端：是交織切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端核苷酸次序是互補，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI識別次序為：5’……G|AATTC……3’3’……CTTAA|G……5’在雙鏈上交織切割位置切割后生成5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一個單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa，其斷裂磷酸二酯鍵以及氫鍵可經(jīng)過DNA連接酶作用而“粘合”。4/25/202321核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第21頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析1、限制性酶切圖譜平頭末端：II型酶切割方式另一個是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。比如EcoRV識別位置是：5’……GAT|ATC……3’3’……CTA|TAG……5’切割后形成5’……GATATC……3’3’……CTATAG……5’這種末端一樣能夠經(jīng)過DNA連接酶連接起來。4/25/202322核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第22頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析1、限制性酶切圖譜限制性內(nèi)切酶應(yīng)用:

廣泛應(yīng)用于各種DNA分子體外重組，限制酶譜繪制，基因和染色體結(jié)構(gòu)分析及基因體外突變等方面；即使限制酶反應(yīng)本身比較簡單，但在限制酶選擇上往往極富挑戰(zhàn)性；需要掌握不一樣限制酶不一樣識別序列和酶切特征。4/25/202323核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第23頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析限制性內(nèi)切酶數(shù)據(jù)庫（TheRestrictionEnzymeDatabase，REBASE）REBASE聚集了大量限制性內(nèi)切酶和相關(guān)蛋白信息，是一個相當(dāng)全方面數(shù)據(jù)庫。它包含有已出版和還未出版參考資料、識別和切割位點、同裂酶、有沒有商品化、甲基化敏感性、晶體結(jié)構(gòu)以及序列數(shù)據(jù)，同時也包含了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、歸位酶、切刻酶、特異性亞單位和參考蛋白資料；搜集超出3,500種限制性內(nèi)切酶信息和6,600篇參考資料一個很主要特征在于主頁提供了搜索整個數(shù)據(jù)庫信息路徑，而且，在每一網(wǎng)頁之間也能相互鏈接；網(wǎng)址：4/25/202324核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第24頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析REBASE數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站主頁4/25/202325核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第25頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析4/25/202326核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第26頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析限制性酶切圖譜分析工具（NEBcutterV2.0)4/25/202327核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第27頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析限制性酶切圖譜4/25/202328核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第28頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析限制性酶切圖譜分析工具（DNAMAN軟件）4/25/202329核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第29頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析引物設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)引物要跟模板緊密結(jié)合；引物與引物之間不能有穩(wěn)定二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在；引物不能在別非目標(biāo)位點引發(fā)高效DNA聚合反應(yīng)(即錯配)。2、PCR引物設(shè)計4/25/202330核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第30頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析引物設(shè)計關(guān)鍵點

普通引物長度為16-23bp，慣用長度為18-21bp，過長或過短都不適當(dāng)。引物3’端堿基普通不用A，因為A在錯誤引發(fā)位點引發(fā)效率相對比較高，而其它三種堿基錯誤引發(fā)效率相對小一些。引物GC含量普通為45-55%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物GC含量不能相差太大。引物所對應(yīng)模板序列Tm值最好在72℃左右，當(dāng)然因為模板序列本身組成決定其Tm值可能偏低或偏高，可依據(jù)詳細(xì)情況靈活利用。

4/25/202331核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第31頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析

ΔG值反應(yīng)了引物與模板結(jié)合強(qiáng)弱程度，也是一個主要引物評價指標(biāo)。普通情況下，應(yīng)該選取3’端ΔG值相對較低（絕對值不超出9），而5’端和中間部分ΔG值較高引物。引物與模板應(yīng)含有較高結(jié)合能量，這么有利于引物與模板序列整合，所以5’端與中間段ΔG值應(yīng)較高，而3’端ΔG值影響DNA聚合酶對模板DNA解鏈，過高則不利于這一步驟。引物設(shè)計關(guān)鍵點4/25/202332核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第32頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析引物設(shè)計關(guān)鍵點引物序列在模板內(nèi)應(yīng)該沒有相同性較高，尤其是3’端相同性較高序列，不然輕易造成錯配。引物3’端出現(xiàn)3個以上連續(xù)堿基如GGG或CCC等，也會增加錯誤引發(fā)幾率。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)能量普通不要超出4.5kmol/mol，不然輕易產(chǎn)生引物二聚體帶，且會降低引物濃度從而造成PCR正常反應(yīng)不能進(jìn)行。對引物修飾普通是在5’端增加酶切位點，應(yīng)參考載體限制酶識別序列確定，經(jīng)常對上下游引物修飾序列選取不一樣限制酶識別序列，以有利于以后工作。4/25/202333核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第33頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分析引物在線設(shè)計Primer3（/)4/25/202334核酸和蛋白質(zhì)序列分析專家講座第34頁生物信息學(xué)第六章、核酸和蛋白質(zhì)序列分