生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座

生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)整機(jī)制不會(huì)有代謝產(chǎn)物積累解除或突破微生物代謝調(diào)整控制目標(biāo)產(chǎn)物積累微生物育種目標(biāo)方法：突變、體內(nèi)重組體外重組（基因工程）4、工業(yè)微生物育種生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第1頁4.1從自然界中取得新菌種微生物資源分布土壤、水、空氣、動(dòng)植物及其腐敗殘骸都是微生物主要棲居和生長繁殖場所分離微生物新種步驟采樣、增殖、純化和性能測定等步驟。生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第2頁經(jīng)典微生物采樣和篩選方法生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第3頁直接從自然界分離得到菌株為野生型菌株。往往低產(chǎn)甚至不產(chǎn)所需產(chǎn)物，只有經(jīng)過深入人工改造才能真正用于工業(yè)生產(chǎn)菌種選育突變、體內(nèi)重組體外重組（基因工程）生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第4頁4.2誘變育種化學(xué)誘變物理誘變紫外線5-溴尿密啶4.2.1紫外線誘變造成DNA鏈斷裂，或使DNA分子內(nèi)或分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)機(jī)理生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第5頁交聯(lián)是由二聚體引發(fā)，二聚體能夠在同一條鏈相鄰堿基之間產(chǎn)生，也能夠是在二條鏈堿基之間形成。研究比較清楚引發(fā)DNA復(fù)制錯(cuò)誤嘧啶比嘌呤對紫外線敏感得多胸腺嘧啶二聚體生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第6頁嘧啶紫外線光化產(chǎn)物生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第7頁誘變過程中需要注意光復(fù)活作用微生物等生物細(xì)胞內(nèi)存在光復(fù)活酶光復(fù)活酶識(shí)別胸腺嘧啶二聚體，并與之結(jié)合形成復(fù)合物打開二聚體，將DNA復(fù)原?？梢姽夤饽埽?00-500nm）激活光復(fù)活酶此時(shí)光復(fù)活酶沒有活性生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第8頁P(yáng)RE為光復(fù)活酶生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第9頁暗修復(fù)細(xì)胞內(nèi)還存在另一個(gè)修復(fù)體系，它不需要光激活可修復(fù)由紫外線、γ射線和烷化劑等對DNA造成損傷。暗修復(fù)體系有四種酶參加反應(yīng)。生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第10頁核酸內(nèi)切酶切開二聚體5’末端,形成3’-OH和5’-P單鏈缺口核酸外切酶從5’-P到3’-OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口DNA聚合酶以另一條互補(bǔ)鏈為模板，從原有鏈上暴露3’-OH端起合成缺失片段連接酶將新合成鏈3’-OH與原鏈5’-P相連接生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第11頁紫外誘變特點(diǎn)方便、誘變效果很好慣用誘變劑在紅光下操作或暗培養(yǎng)參數(shù)：紫外燈功率、工作距離、照射時(shí)間生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第12頁4.2.25-溴尿嘧啶誘變——堿基類似物機(jī)理：與堿基結(jié)構(gòu)類似，在DNA復(fù)制時(shí)，它們能夠被錯(cuò)誤地?fù)饺隓NA，引發(fā)誘變效應(yīng)酮式5-BU結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶相同，與A配對5-BU很輕易進(jìn)行酮式與烯醇式結(jié)構(gòu)互變異構(gòu)烯醇式5-BU不與A而與G配對A：TG：C

參數(shù)：濃度、時(shí)間、緩沖液生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第13頁誘變育種基本過程以下：在誘變處理前，普通應(yīng)預(yù)先做誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量致死曲線，選擇適當(dāng)處理劑量。適當(dāng)誘變劑量選擇生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第14頁出發(fā)菌株選擇一是考慮出發(fā)菌株是否含有特定生產(chǎn)性狀能力或潛力，即菌株是否含有產(chǎn)生特定代謝產(chǎn)物催化酶系基因。自然界直接分離到野生型菌株經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗(yàn)菌株已經(jīng)歷屢次育種處理菌株菌株起源其次是出發(fā)菌株最好已具備一些有利性狀，如生長速度快、營養(yǎng)要求低和產(chǎn)孢子早而多菌株。生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第15頁制備菌懸液待處理菌懸液應(yīng)考慮微生物生理狀態(tài)、懸液均一性和環(huán)境條件。普通要求菌體處于對數(shù)生長久，并采取一定辦法促使細(xì)胞處于同時(shí)生長。懸液均一性可確保誘變劑與每個(gè)細(xì)胞機(jī)會(huì)均等并充分地接觸，防止出現(xiàn)不純菌落，給后續(xù)篩選工作造成困難。用玻璃珠振蕩打散細(xì)胞團(tuán)，再用脫脂棉花或?yàn)V紙過濾，得到分散菌體。產(chǎn)孢子或芽孢微生物最好采取其孢子或芽孢生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第16頁菌懸液細(xì)胞濃度普通控制為：真菌孢子或酵母細(xì)胞106107個(gè)/ml，放線菌或細(xì)菌108個(gè)/ml。菌懸液普通用生理鹽水（0.85%NaCl）稀釋。誘變處理在誘變處理前，普通應(yīng)預(yù)先做誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量致死曲線，選擇適當(dāng)處理劑量。適當(dāng)誘變劑量選擇就普通微生物而言，突變率隨劑量增大而增高，但到達(dá)一定劑量后，再加大劑量反而會(huì)使突變率下降。致死率在70%-80%

生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第17頁誘變育種中還經(jīng)常采取誘變劑復(fù)合處理，使它們產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第18頁4.2.2菌種篩選策略篩選伎倆必需配合不一樣篩選階段要求初篩：要力爭快速、簡便復(fù)篩：應(yīng)該做到準(zhǔn)確，測得數(shù)據(jù)要能夠反應(yīng)未來生產(chǎn)水平(1)從菌體形態(tài)變異分析——初篩有些菌體形態(tài)變異與產(chǎn)量變異存在著一定相關(guān)性，在篩選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些直接形態(tài)特征性改變。

生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第19頁平皿快速檢測法平皿快速檢測法是利用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上生理生化反應(yīng)，將肉眼觀察不到產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見“形態(tài)”改變。紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等?！ㄐ曰虬攵坑茫蟠筇嵘Y選效率——初篩生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第20頁微生物特異性平板檢測方法生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第21頁飽浸含某種指示劑固體培養(yǎng)基濾紙片變色圈指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉平皿上噴上稀碘液固體培養(yǎng)基中滲透溶解性差、可被特定菌利用營養(yǎng)成份，造成不透明培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈。利用一些有尤其營養(yǎng)要求微生物作為工具菌，如待篩選菌含有該營養(yǎng)物前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物能力，工具菌就能圍繞該菌生長待篩選菌株能分泌產(chǎn)生一些能抑制工具菌生長物質(zhì)生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第22頁搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法是將待測菌株單菌落分別接種到三角瓶培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，然后，再對培養(yǎng)液進(jìn)行分析測定。特殊變異菌篩選方法營養(yǎng)缺點(diǎn)型突變株抗阻遏和抗反饋突變型抗生素抗性突變株條件抗性突變生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第23頁營養(yǎng)缺點(diǎn)型突變株濃縮、深入檢出和判別營養(yǎng)缺點(diǎn)型等步驟。篩選步驟：濃縮營養(yǎng)缺點(diǎn)型菌株慣用濃縮方法有抗生素法、菌絲過濾法、差異殺菌法和饑餓法等。目標(biāo)：淘汰大量野生型，使?fàn)I養(yǎng)缺點(diǎn)型占百分比增加生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第24頁深入檢出所需缺點(diǎn)型逐一檢出法影印培養(yǎng)法生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第25頁普通從菌落大小也能夠判斷，新長出菌落較小，即是營養(yǎng)缺點(diǎn)型夾層培養(yǎng)法營養(yǎng)缺點(diǎn)型判定取得營養(yǎng)缺點(diǎn)型菌株還應(yīng)深入確認(rèn)其生長所需物。生長譜法組合補(bǔ)充培養(yǎng)基法生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第26頁營養(yǎng)缺點(diǎn)型應(yīng)用

利用營養(yǎng)缺點(diǎn)型突變株來生產(chǎn)氨基酸和核苷酸是經(jīng)典例子生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第27頁天冬氨酸激酶(AK)被賴氨酸及蘇氨酸協(xié)同反饋所抑制經(jīng)過誘變處理，取得高絲氨酸缺點(diǎn)型突變菌株，該突變型不能產(chǎn)生蘇氨酸。在限量高絲氨酸培養(yǎng)基中缺點(diǎn)型菌株能夠正常生長，而且因?yàn)橄朔答佉种仆蛔冃湍苓^量生產(chǎn)L-賴氨酸生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第28頁抗阻遏和抗反饋突變型抗阻遏和抗反饋突變型都是因?yàn)榇x失調(diào)所造成，在細(xì)胞中已經(jīng)有大量最終代謝產(chǎn)物時(shí)依然繼續(xù)不停地合成這一產(chǎn)物。選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株結(jié)構(gòu)類似物是指一些和細(xì)菌體內(nèi)氨基酸、嘌呤、維生素等代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相類似物質(zhì)主要用于末端產(chǎn)物積累生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第29頁抗性突變菌株篩選抗生素抗性突變株在抗生素產(chǎn)生菌選育中，經(jīng)過篩選抗生素抗性突變可提升抗生素產(chǎn)量。抗生素抗性突變株除能提升抗生素產(chǎn)量外，還能提升其它代謝產(chǎn)物量。條件抗性突變因環(huán)境不一樣，能表現(xiàn)為"野生型"菌株特征和突變型菌株特征突變稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。溫度敏感突變慣用于提升代謝產(chǎn)物產(chǎn)量致死營養(yǎng)缺點(diǎn)生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第30頁抗性突變菌株篩選方法一次性篩選法一次性篩選法就是指在對出發(fā)菌株完全致死環(huán)境中，一次性篩選出少許抗性變異株。噬菌體抗性菌株耐高溫菌株生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第31頁階梯性篩選法梯度平板法生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第32頁紙片擴(kuò)散法用打孔器將較厚濾紙（如新華六號(hào)）打成小圓片，并使紙片吸收一定濃度藥品，經(jīng)干燥或不經(jīng)干燥，放入涂布了菌懸液平板上，普通9厘米培養(yǎng)皿中等距放置三片為宜。經(jīng)培養(yǎng)后觀察圍繞紙片抑菌圈，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)可能就是抗性菌。組成酶變異株篩選誘導(dǎo)酶生產(chǎn)需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物影響。能快速利用碳源（如葡萄糖）會(huì)引發(fā)酶合成降低，誘導(dǎo)物有時(shí)又比較昂貴。生產(chǎn)成本提升生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第33頁控制酶合成調(diào)整基因發(fā)生了變異誘導(dǎo)酶轉(zhuǎn)變成組成型酶詳細(xì)篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法恒化器法：恒化器常被用于微生物“馴化”，添加不能起誘導(dǎo)作用低濃度底物，遲緩生長循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導(dǎo)物培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導(dǎo)物培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。誘導(dǎo)抑制劑法：加入誘導(dǎo)抑制劑如α-硝基苯基-β-巖藻糖苷阻止一些誘導(dǎo)酶合成生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第34頁4.3體內(nèi)基因重組育種接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和原生質(zhì)體融合等遺傳學(xué)方法和技術(shù)使微生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生基因重組4.3.1.原生質(zhì)體融合將遺傳性狀不一樣兩種菌(包含種間、種內(nèi)及屬間)融合為一個(gè)新細(xì)胞技術(shù)。選擇親株、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生和融合子選擇等步驟步驟生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第35頁微生物原生質(zhì)體融合普通原理和過程生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第36頁選擇親株選擇遺傳性狀穩(wěn)定且含有優(yōu)勢互補(bǔ)兩個(gè)親株為了能明確檢測到融合子，參加融合親株普通都需要帶有能夠識(shí)別遺傳標(biāo)識(shí)，如營養(yǎng)缺點(diǎn)型或抗藥性等原生質(zhì)體制備去除細(xì)胞壁是制備原生質(zhì)體關(guān)鍵生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第37頁革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成溶菌酶微球菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌革蘭氏陰性菌不能直接溶壁，只有當(dāng)乙二胺四乙酸（EDTA）存在時(shí)，一些革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁才能夠被溶菌酶溶解。金黃色葡萄球菌溶菌酶不能溶解表皮葡萄球菌能產(chǎn)生一個(gè)內(nèi)肽酶——葡萄球菌素，溶解生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第38頁放線菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌也可采取溶菌酶真菌細(xì)胞壁主要由纖維素、幾丁質(zhì)和葡聚糖等組成青霉菌多用纖維素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁曲霉用-1,3-糖苷酶和-1,4-糖苷酶等酵母菌細(xì)胞壁中葡聚糖和幾丁質(zhì)蝸牛酶生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第39頁生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第40頁培養(yǎng)基中添加甘氨酸，能夠使菌體較輕易被酶解在菌體生長階段添加蔗糖也能提升細(xì)胞壁對溶菌酶敏感性在菌體生長對數(shù)期加入適量青霉素，就能使細(xì)胞對溶菌酶更敏感菌齡：對數(shù)生長中期細(xì)胞細(xì)胞壁中肽聚糖含量很低，對溶菌酶敏感。原生質(zhì)體制備其它原因：普通是將原生質(zhì)體放在高滲環(huán)境中以維持它穩(wěn)定性生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第41頁原生質(zhì)體融合聚乙二醇（PEG）能有效地促進(jìn)原生質(zhì)體融合普通PEG使用濃度范圍在25-40%采取電融合儀：在高頻電場下，用直流電穿孔來進(jìn)行融合原生質(zhì)體再生使原生質(zhì)體重新長出細(xì)胞壁，恢復(fù)完整細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第42頁不一樣微生物原生質(zhì)體最適再生條件不一樣，最主要一個(gè)共同點(diǎn)是都需要高滲透壓再生率細(xì)菌為3-10%真菌在20-80%融合重組子篩選經(jīng)過兩親株遺傳標(biāo)識(shí)互補(bǔ)而得以識(shí)別兩親株遺傳標(biāo)識(shí)分別為營養(yǎng)缺點(diǎn)型A+B-和A-B+，融合重組子應(yīng)是A+B+或A-B-生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第43頁重組子檢出方法有兩種：直接法將融合液涂布在不補(bǔ)充親株生長需要生長因子高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子間接法把融合液涂布在營養(yǎng)豐富高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。生物進(jìn)化過程中微生物形成完善代謝調(diào)節(jié)機(jī)制專家講座第44頁融合重組頻率=融合重組子兩親株原生質(zhì)體再生菌落總數(shù)4.3.2雜交育種進(jìn)行體內(nèi)基因重組育種其它方法包含接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多主要具生產(chǎn)價(jià)值微生物雜交、有性世代等還未揭示