免疫組化與原位雜交

免疫組織化學(xué)前提條件：所使用抗體必須能用于免疫組化。一、基本原理：利用抗體（antibody）與對應(yīng)抗原（antigen）特異性結(jié)合,經(jīng)過與抗體連接酶反應(yīng)或熒光染料顯示抗原所在位置。免疫組化與原位雜交第1頁二、慣用于標(biāo)識(shí)抗體標(biāo)識(shí)物一）酶（enzyme）1.辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）

辣根過氧化物酶作用物（底物，substrate）1）二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）顯色特點(diǎn)：

---

棕色

---不溶于水及脂類溶劑（酒精ethanol,二甲苯xylene）

---不擴(kuò)散

---永久保留2）3氨基9乙基卡巴唑（3-Amino-9-Ethylcarbazole，AEC）免疫組化與原位雜交第2頁顯色特點(diǎn)：---棕紅色---不溶于水，但溶于脂類溶劑---輕易擴(kuò)散---不能永久保留3）4氯1萘酚（4-Chloro-1-naphthol，CN）

顯色特點(diǎn)：

---藍(lán)色---不溶于水，但溶于脂類溶劑---輕易擴(kuò)散---不能永久保留4）四甲基聯(lián)苯胺（3,3‘,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB）

顯色特點(diǎn)：

---深藍(lán)色免疫組化與原位雜交第3頁---不溶于水及脂類溶劑---不擴(kuò)散---永久保留2.堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP）

堿性磷酸酶作用物（底物，substrate）1）四唑淡藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(Nitro-Blue-Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-inodlyl-phosphate,NBT/BCIP）

顯色特點(diǎn)：---紫色---不溶于水但溶于脂類溶劑---輕易擴(kuò)散---不能永久保留免疫組化與原位雜交第4頁2）快紅（固紅/萘酚磷酸鹽，F(xiàn)astRedTR/NaphtholAS-MX）顯色特點(diǎn)：---桃紅色---不溶于水但溶于脂類溶劑---輕易擴(kuò)散---不能永久保留3）快藍(lán)（固藍(lán)BB/萘酚磷酸鹽，F(xiàn)astBlueBB/NaphtholAS-MX)顯色特點(diǎn)：---藍(lán)色---不溶于水但溶于脂類溶劑---輕易擴(kuò)散---不能永久保留4）品紅（品紅/萘酚磷酸鹽，F(xiàn)uchsin/NaphtholAS-TR）免疫組化與原位雜交第5頁顯色特點(diǎn)：---紅色---不溶于水及脂類溶劑---不擴(kuò)散---永久保留DABFastblueFastredNBT/BCIPAEC免疫組化與原位雜交第6頁二）熒光染料（fluorescentdye）免疫組化與原位雜交第7頁免疫組化與原位雜交第8頁免疫組化與原位雜交第9頁慣用熒光染料1.異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）分子量為389，最大吸收光波長為490～495nm，最大發(fā)射光波長為520～530nm，展現(xiàn)明亮黃綠色熒光，是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛熒光素。2.四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TMRITC）分子量為444，最大吸收光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，展現(xiàn)橙紅色熒光。免疫組化與原位雜交第10頁3.羰花青類（carbocyaninedyes)熒光較強(qiáng)，不易淬滅，近年來應(yīng)用廣泛。4.AlexaFluor免疫組化與原位雜交第11頁吸收光涉及發(fā)射光波長范圍廣，也是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛熒光素。免疫組化與原位雜交第12頁三）生物素(維生素H,Biotin)水溶性維生素，屬于維生素B族。相對分子量244，分子結(jié)構(gòu)簡單，經(jīng)過其羧基與被標(biāo)識(shí)物氨基結(jié)合，可標(biāo)識(shí)抗體、酶、激素、核酸、凝集素等，因?yàn)槠浞肿有?，不影響被?biāo)識(shí)物理化和免疫學(xué)特征。極易于親和素（Avidin）結(jié)合，形成親和素-生物素復(fù)合物（Avidin-biotincomplex,ABC）所以，常與親和素一起被用于免疫組化ABC方法中。四）膠體金（colloidalgold）又稱金溶膠（goldsolution），是指分散相粒子直徑在l—150nm之間金溶膠，

能穩(wěn)定又快速地吸附蛋白質(zhì)，能夠作為標(biāo)識(shí)物標(biāo)識(shí)抗體、抗原、激素、核酸等，在藥品檢測、生物醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，慣用于透射電鏡。

免疫組化與原位雜交第13頁三、組織標(biāo)本制備一）組織標(biāo)本取材取材標(biāo)準(zhǔn):盡可能快切取所需組織浸入固定液或快速冰凍,保持組織新鮮以最大程度地預(yù)防抗原破壞和降解。二）固定（Fixation):依據(jù)所檢測抗原性質(zhì)選擇適當(dāng)固定液和固定方法，固定液用量應(yīng)是標(biāo)本40倍。1.慣用固定劑(Fixativesolution)1）單純固定劑

①丙酮(Acetone)：主要用于新鮮組織冰凍切片快速固定，以檢測細(xì)胞表面抗原、本身抗體及細(xì)胞內(nèi)外免疫球蛋白。②甲醇(Methanol)：與丙酮相同。免疫組化與原位雜交第14頁③乙醇(Ethanol):與丙酮相同。④甲醛(formaldehyde):使用最廣泛固定劑，有各種劑型，包括：

福馬林（formol）:即10%甲醛水溶液，最慣用固定劑，適合用于各種組織固定。中性福馬林：含過飽和碳酸鈣（calciumcarbonate)10%甲醛水溶液。緩沖中性福馬林：以磷酸鹽緩沖液配制10%甲醛溶液。4%多聚甲醛（paraformaldehyde）：以磷酸鹽緩沖液配制4%多聚甲醛溶液。2）復(fù)合固定劑免疫組化與原位雜交第15頁Bouin氏液：含苦味酸（nitroxanthicacid）和冰醋酸（glacialaceticacid）甲醛溶液。Zamboni氏液：含苦味酸和冰醋酸多聚甲醛溶液。PLP（periodate-lysine-paraformaldehyde）：含過碘酸和賴氨酸多聚甲醛溶液，多用于需預(yù)固定冰凍組織切片。

2.固定方法：必須用預(yù)冷（4℃）固定液固定，并保持低溫持

續(xù)固定至所需時(shí)間。

1）灌注固定（perfusionfixation）：最好固定方法，尤其適用于神經(jīng)組織如腦、脊髓和視網(wǎng)膜。灌注固定后應(yīng)快速切取所需組織，在預(yù)冷固定液中繼續(xù)浸泡固定至所需時(shí)間。2）浸泡固定：最普通和慣用固定方法，適合用于除神經(jīng)組織外各種組織。免疫組化與原位雜交第16頁三）包埋和切片（embeddingandsection）1.石蠟切片基本步驟：1）逐層乙醇溶液脫水：使組織脫水，便于二甲苯（xylene）介入過程。時(shí)間長短取決于組織塊大小及結(jié)構(gòu)。置80%以上乙醇溶液時(shí)間過長，會(huì)使組織變硬變脆，應(yīng)該防止。70%80%90%100%I100%II100%III

2）透明：組織用二甲苯處理方便石蠟介入過程，時(shí)間長短取決于組織快大小，但不宜過長，以免組織過硬易脆。

二甲苯I二甲苯II二甲苯III3）浸蠟：組織經(jīng)二甲苯（xylene）處理后石蠟介入過程，時(shí)間長短取決于組織快大小。溫度應(yīng)控制在56-60℃。4）包埋：用模具使組織塊包于石蠟中成型過程。免疫組化與原位雜交第17頁5）修快：將包有組織蠟塊用刀切去多出部分，修成一定形狀過程。6）切片：將包有組織蠟塊安裝在切片機(jī)上進(jìn)行切割過程。一般切3–6μm。2.冰凍切片基本步驟：1）固定：依據(jù)所檢測組織抗原性質(zhì)決定是否先進(jìn)行固定及選擇適當(dāng)固定劑。除非有特殊要求，不然應(yīng)該先進(jìn)行固定以預(yù)防抗原破壞及降解。慣用固定液是4%多聚甲醛（paraformaldehyde）2）降低組織水分預(yù)防冰晶形成:通常采取高滲30%蔗糖(sucrose)溶液吸收組織中水分。3）包埋：用于冰凍切片組織包埋劑是OCT(CryoEmbeddingMedium)

免疫組化與原位雜交第18頁4）切片：將包在OCT中組織安裝在冰凍切片機(jī)上進(jìn)行切割，切片厚度普通為5-20μm。5）后固定：適合用于未經(jīng)固定冰凍組織切片，慣用固定液是丙酮（acetone)和4%多聚甲醛。四）預(yù)防脫片辦法：載玻片處理：重鉻酸鉀（bichromicumKalium）濃硫酸（concentratedsulfuricacid）清潔液浸泡24小時(shí)充分流水沖洗去離子水沖洗2遍

烘干2.粘附劑使用：①2%3氨基乙氧基甲硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane,APES）：適合用于石蠟切片載玻片。②0.1%多聚左旋賴氨酸（poly-L-lysine）：適合用于冰凍切片載玻片

免疫組化與原位雜交第19頁四、慣用免疫組化方法一）免疫熒光法（應(yīng)注意標(biāo)本中自發(fā)熒光影響）1.直接法或一步法(directmethodorone-stepstainingmethod)用標(biāo)識(shí)了熒光素特異性抗體直接與標(biāo)本中對應(yīng)抗原結(jié)合。優(yōu)點(diǎn)：特異性高缺點(diǎn)：敏感性低2.間接法（indirectmethod）：熒光素不是標(biāo)識(shí)在與標(biāo)本中對應(yīng)抗原結(jié)合特異性抗體上，而是標(biāo)識(shí)在抗特異性抗體第二抗體上。優(yōu)點(diǎn)：敏感性高缺點(diǎn)：特異性低免疫組化與原位雜交第20頁二）免疫酶法1.直接法或一步法(directmethodorone-stepstainingmethod)用標(biāo)識(shí)了酶特異性抗體直接與標(biāo)本中對應(yīng)抗原結(jié)合，以酶底物反應(yīng)顯示抗原分布。2.間接法(indirectmethod)：

慣用間接法：1）兩步法（two-stepstainingmethod）：優(yōu)點(diǎn):敏感性很高，特異性高，不受內(nèi)源性生物素影響。缺點(diǎn):背景染色高。免疫組化與原位雜交第21頁2)過氧化物酶抗過氧化物酶（peroxidaseanti-peroxidase，PAP）或堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶法（alkalinephosphataseanti-alkalinephosphatase,APAAP）method優(yōu)點(diǎn)：特異性高，背景染色很低，不受內(nèi)源性生物素影響。缺點(diǎn)：敏感性相對低。免疫組化與原位雜交第22頁3.親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(avidin-biotin-eroxidasecomplex，ABC)或鏈親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(labelledstrepavidin-biotin-eroxidasecomplex，LSAB)method

是最廣泛使用但不提議使用方法，因?yàn)楫?dāng)前尚無去除內(nèi)源性生物素和親和素方法。優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，特異性很低。缺點(diǎn)：極易受內(nèi)源性生物素影響，假陽性率極高。免疫組化與原位雜交第23頁五、免疫組織化學(xué)特異性與敏感性一）特異性（specificity):指免疫組化染色結(jié)果是否真正由特異性抗體和對應(yīng)抗原結(jié)合而產(chǎn)生。包含方法特異性和抗體特異性。1.方法特異性：證實(shí)是由抗體結(jié)合引發(fā)結(jié)果。如：加一抗---有染色結(jié)果不加一抗---無染色結(jié)果2.抗體特異性：證實(shí)是由所檢抗原而非其它成份與一抗結(jié)合引發(fā)染色結(jié)果。如：用肝細(xì)胞抗體染肝組織---有染色結(jié)果用肝細(xì)胞抗體染腎組織---無染色結(jié)果二）特異性染色和非特異性染色

1.特異性染色：由一抗與對應(yīng)抗原特異性結(jié)合而產(chǎn)生染色。染

免疫組化與原位雜交第24頁色部位是抗原分布部位，顯示出一定結(jié)構(gòu)背景，如細(xì)胞核﹑細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，或組織和細(xì)胞內(nèi)一些特殊成份。2.非特異性：不是由一抗與對應(yīng)抗原特異性結(jié)合而引發(fā)染色。染色部位與抗原分布部位無關(guān)。3.特異性染色檢測1）設(shè)陽性對照：用已知抗原存在標(biāo)本對比所檢測標(biāo)本。2）設(shè)陰性對照：用已知抗原不存在標(biāo)本或除去一抗方法對比

所檢測標(biāo)本。①陰性標(biāo)本:不存在被檢抗原標(biāo)本。②空白試驗(yàn)：組化染色程序中不加一抗。③替換試驗(yàn)：組化染色程序中用同型（isotype）抗體替換一抗。免疫組化與原位雜交第25頁④吸收試驗(yàn)：組化染色程序中用過量對應(yīng)抗原吸收一抗以阻止標(biāo)本中抗原與一抗結(jié)合。三）敏感性(sensitivity)：指所用免疫組化方法能檢測抗原量。1.敏感性與特異性關(guān)系：普通是相反關(guān)系。2.提升敏感性方法：①選取敏感免疫組化染色方法：如EnVision兩步法，PAP或APAAP法，ABC法。②選取含有放大作用酶免疫組化染色方法：

如堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）對底物（substrate）作用隨時(shí)間增加而增加，可選取含堿性磷酸酶EnVision兩步法或APAAP法。免疫組化與原位雜交第26頁③增加抗體孵育時(shí)間：普通采取4℃過夜方式。四）非特異性染色起源及消除1.標(biāo)本固定不適當(dāng)或不充分丙酮固定標(biāo)本，尤其是它冰凍切片標(biāo)本，有極強(qiáng)非特異性染色。應(yīng)選取適當(dāng)固定劑及充分固定。2.染色過程中切片干燥應(yīng)用濕盒及預(yù)防切片干燥3.內(nèi)遠(yuǎn)性酶活性未被抑制或消耗經(jīng)固定標(biāo)本，其細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶(peroxidase)和堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）不會(huì)被滅活，仍保持活性。過氧化物酶---0.3%H2O2消耗

堿性磷酸酶---左旋咪唑抑制，微波加熱或0.2N鹽酸(HCL)破壞。采取免疫熒光方法。免疫組化與原位雜交第27頁4.游離醛基醛類固定劑未洗凈，殘留游離醛基易與抗體非特異性結(jié)合。徹底沖洗及用賴氨酸、甘氨酸、白蛋白或正常血清封閉。5.Fc受體標(biāo)本中，尤其是冰凍切片或細(xì)胞甩片中，細(xì)胞膜上免疫球蛋白(immunoglobulin)Fc受體與抗體結(jié)合。與二抗同源血清或非特異性抗體封閉。6.疏水鍵和離子鍵免疫球蛋白可經(jīng)過疏水鍵和離子鍵與標(biāo)本中蛋白及其它成份非特異性結(jié)合，抗血清中補(bǔ)體也可經(jīng)過疏水鍵和離子鍵與標(biāo)本中蛋白結(jié)合，再與抗體結(jié)合。正常血清封閉盡可能稀釋抗體滅活補(bǔ)體增加抗體稀釋液離子強(qiáng)度（將PBS改為TBS）抗體稀釋液中添加去污劑（如TritonX-100,Twen-20)免疫組化與原位雜交第28頁7.天然抗體接收免疫動(dòng)物在自然過程中產(chǎn)生對一些動(dòng)物組織或血清成份抗體。用相對應(yīng)動(dòng)物血清或組織成份吸收,或盡可能提升抗體稀釋度。8.雜質(zhì)抗體因?yàn)槊庖咴患?，混有一些組織成份免疫動(dòng)物所產(chǎn)生抗體。盡可能提升抗體稀釋度。9.自發(fā)熒光標(biāo)本中一些成份如紅細(xì)胞、彈性纖維、脂質(zhì)等有自發(fā)熒光。改用免疫顯色方法。六、免疫組化雙重及多重染色一）免疫熒光雙重及多重染色

免疫組化與原位雜交第29頁1.免疫熒光雙重染色1)直接法：

直接用不一樣熒光染料標(biāo)識(shí)兩種抗體孵育標(biāo)本。如用FITC-CD45antibody（綠色）和Alexaflour555-CD20

antibody（紅色）檢測淋巴組織中T細(xì)胞和B細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：特異性高，方法簡單，可用起源于同一宿主（host）抗體。缺點(diǎn)：敏感性低。2)間接法:①第一抗體起源于非同一個(gè)屬,可用以下方法：

A)先用各自非標(biāo)識(shí)一抗孵育標(biāo)本，再用不一樣熒光染料標(biāo)識(shí)各自二抗結(jié)合一抗。二抗能夠是起源于同一個(gè)屬，也能夠不是。免疫組化與原位雜交第30頁如：一抗:mouseanti-CD45rabbitanti-CD20二抗:FITC-goatanti-mouse

IgG

TRITC-goatanti-rabbitIgG

(green)orTRITC-donkeyanti-rabbitIgG

(red)優(yōu)點(diǎn)：增加了敏感性。缺點(diǎn)：需用3-4種抗體，且一抗不能起源于同一個(gè)屬。因?yàn)樗每贵w起源于不一樣種屬，存在交叉反應(yīng)可能性，使用前需進(jìn)行種屬間交叉試驗(yàn)。B)也可先完成第一套抗體顯示第一抗原，再進(jìn)行第二套抗體顯示第二抗原。②第一抗體起源于同一個(gè)屬，可采取以下方法進(jìn)行：A)在完成第一套抗體顯示第一抗原及保留了對應(yīng)圖像后，用微波處理滅活第一套抗體，再進(jìn)行第二套抗體顯示第二抗原。兩套二抗能夠是起源于同一個(gè)屬，也能夠不是,但須標(biāo)識(shí)不一樣熒光染料。免疫組化與原位雜交第31頁B)在完成第一套抗體顯示第一抗原后，用飽和與第一套一抗同一種屬免疫球蛋白封閉第一套抗體中二抗未結(jié)合位點(diǎn)，再用熒光標(biāo)識(shí)第二套一抗直接進(jìn)行第二抗原顯示。2.免疫熒光多重染色

理論上能夠使用N個(gè)不一樣熒光染料標(biāo)識(shí)抗體檢測N個(gè)不一樣抗原，實(shí)際使用上受熒光顯微鏡設(shè)置熒光通道限制。通常熒光顯微鏡最多只能設(shè)置3-4個(gè)熒光通道。1)直接法：可直接用3個(gè)或3個(gè)以上不一樣熒光染料標(biāo)識(shí)一抗顯示對應(yīng)抗原。2)間接法:優(yōu)點(diǎn)：可在一標(biāo)本上檢測3個(gè)或3個(gè)以上不一樣抗原。缺點(diǎn)：因?yàn)椴灰粯臃N屬起源抗體間存在交叉反應(yīng)可能性大，非特異性反應(yīng)極高。

免疫組化與原位雜交第32頁①第一抗體起源于非同一個(gè)屬，可用以下方法：A)先用3種或3種以上不一樣種屬非標(biāo)識(shí)一抗孵育標(biāo)本，再用不一樣熒光染料標(biāo)識(shí)二抗各自結(jié)合一抗，一抗和二抗間不能有起源于同一個(gè)屬抗體。B)也可按先后次序進(jìn)行各套抗體顯示各自抗原。②第一抗體起源于同一個(gè)屬：可在完成每套抗體顯示各自抗原及保留了對應(yīng)圖像后，用微波處理滅活各套抗體,再進(jìn)行后續(xù)不一樣熒光各套抗體顯示后續(xù)各個(gè)抗原。

此方法前提條件是后續(xù)各個(gè)抗原能耐受微波處理。二）免疫酶雙重及多重染色前提條件：必須預(yù)先去除內(nèi)源性因數(shù)（如過氧化物酶，堿性磷酸酶，生物素，親和素等）影響。應(yīng)該提醒是，當(dāng)前尚無方法去除內(nèi)源性生物素和親和素。免疫組化與原位雜交第33頁1.免疫酶雙重染色1)直接法：先去除內(nèi)源性因數(shù)(如過氧化物酶，堿性磷酸酶，生物素，親和素等)活性,再加不一樣酶標(biāo)識(shí)抗體,以各自抗體標(biāo)識(shí)酶底物反應(yīng)顯示抗原分布。如用HRP-CD68antibody和AP-CD105antibody檢測炎癥組織中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,分別以DAB

(棕色)和fastred（紅色）顯色。優(yōu)點(diǎn)：特異性高，方法簡單，可用起源于同一宿主抗體。缺點(diǎn)：敏感性低,必須用不一樣標(biāo)識(shí)酶及底物。2)間接法:優(yōu)點(diǎn)：敏感性高。缺點(diǎn)：特異性低。①第一抗體起源于非同一個(gè)屬，可用以下方法：A)先用各自非標(biāo)識(shí)一抗孵育標(biāo)本，再加不一樣酶標(biāo)識(shí)二抗系統(tǒng)(如HRP-polymer和AP-polymer,SP-ABC和SAP-ABC)及酶底物顯示各自免疫組化與原位雜交第34頁

抗原。二抗系統(tǒng)能夠是起源于同一個(gè)屬，也能夠不是，但必須標(biāo)

記不一樣酶。B)也可先完成第一套抗體系統(tǒng)顯示第一抗原，再進(jìn)行第二套抗體系統(tǒng)顯示第二抗原。它們二抗系統(tǒng)能夠是起源于同一個(gè)屬，也可以不是，但必須標(biāo)識(shí)不一樣酶。C)如欲使用PAP和APAAP二抗系統(tǒng)，則二抗系統(tǒng)之間及二抗系統(tǒng)與一抗之間不能有起源于同一個(gè)屬抗體。②第一抗體起源于同一個(gè)屬：

可在完成第一套抗體顯示第一抗原后,用微波處理滅活第一套抗體，再進(jìn)行第二套抗體顯示第二抗原。兩套二抗能夠是起源于同一個(gè)屬，也能夠不是,但必須標(biāo)識(shí)不一樣酶。2.免疫酶多重染色理論上能夠使用N個(gè)不一樣酶標(biāo)識(shí)抗體顯示N個(gè)不一樣抗原，實(shí)際使用上受慣用標(biāo)識(shí)酶限制。通常最慣用是過氧化物酶和堿性磷免疫組化與原位雜交第35頁酸酶，而酶底物則相對多些。1)直接法:受慣用標(biāo)識(shí)酶限制,實(shí)際上只能直接用2個(gè)不一樣酶標(biāo)識(shí)一抗顯示對應(yīng)2個(gè)抗原。2)間接法:因?yàn)樾栌萌谆蛉滓陨峡贵w系統(tǒng)，抗體間存在交叉反應(yīng)可能性大，非特異性反應(yīng)強(qiáng)，所以最好方法是在完成每套抗體顯示各自抗原后，用微波處理滅活各套抗體,再進(jìn)行后續(xù)不一樣套抗體顯示后續(xù)各個(gè)抗原。

此方法前提條件是后續(xù)各個(gè)抗原能耐受微波處理。三）免疫酶及免疫熒光雙重及多重染色普通先進(jìn)行免疫酶染色，再進(jìn)行免疫熒光染色。因?yàn)橥ǔＶ挥屑t、綠、棕、藍(lán)（或紫）4種顏色可用，故至多只能進(jìn)行1-2種免疫組化染色和2-3種免疫熒光染色組合。免疫組化與原位雜交第36頁

原位雜交

也被稱作原位雜交組織化學(xué)(Insituhybridizationhisto-chemistry），簡稱原位雜交(insituhybridization,ISH)和熒光原位雜交(fluoresceininsituhybridization,FISH)

一、基本原理：利用兩條互補(bǔ)單核苷酸鏈，在適當(dāng)溫度和離子濃度下，經(jīng)過互補(bǔ)堿基對之間氫鍵緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定雜交雙鏈特征，將帶有標(biāo)識(shí)物已知核酸某段堿基序列做為探針，與標(biāo)本中相應(yīng)核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，再應(yīng)用與標(biāo)識(shí)物對應(yīng)檢測系統(tǒng)，經(jīng)過熒光、免疫酶染色或放射性核素顯示雜交信號(hào)，進(jìn)行對應(yīng)核酸在細(xì)胞內(nèi)定位及定量。二、探針制備：

免疫組化與原位雜交第37頁一）探針種類1.基因組DNA探針：是使用最廣泛探針,可經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和PCR方法取得。因?yàn)檫@類探針是雙鏈DNA,使用前必須進(jìn)行變性處理。2.cDNA探針：cDNA是互補(bǔ)于mRNADNA分子,可從cDNA文庫中克隆取得,也可通過RT-PCR方法取得，因?yàn)檫@類探針也是雙鏈DNA,使用前也必須進(jìn)行變性處理。3.寡核苷酸探針：經(jīng)過化學(xué)合成技術(shù)合成單鏈DNA，普通長度為20-50bp。以上都是DNA探針，因?yàn)镈NA與DNA或RNA結(jié)合效率低，故敏感性低，且無法做正義(sense)和反義(antisense)探針對照試驗(yàn)，普通用于DNA雜交檢測。免疫組化與原位雜交第38頁4.cRNA探針：cRNA探針是以cDNA為模板在體外轉(zhuǎn)錄而成單鏈RNA探針。因?yàn)樗荝NA，與DNA或RNA結(jié)合效率高，故敏感性高，并可做sense和antisense探針對照試驗(yàn)，慣用于mRNA雜交檢測,也可用于DNA雜交檢測。二）探針標(biāo)識(shí)1.探針標(biāo)識(shí)物：標(biāo)識(shí)物被標(biāo)識(shí)在核酸(NTP)或脫氧核酸(dNTP)上，隨RNA或DNA合成而摻入。1）放射性標(biāo)識(shí)物：慣用放射性標(biāo)識(shí)物是32P(磷)、3H(氚)和35S(硫)。2）非放射性標(biāo)識(shí)物：慣用非放射性標(biāo)識(shí)物是digoxigenin(地高辛)、fluoresceinisothiocyanate（FITC，異硫氰酸熒光素）和biotin(生物素)。免疫組化與原位雜交第39頁2.探針標(biāo)識(shí)方法：1)DNA探針標(biāo)識(shí)方法:①缺口平移法(nicktranslation)②隨機(jī)引物法(randomprimer)免疫組化與原位雜交第40頁③末端標(biāo)識(shí)法(end-labelling)B)T4聚合酶替換法A)3′末端標(biāo)識(shí)法免疫組化與原位雜交第41頁④PCR擴(kuò)增標(biāo)識(shí)法2)RNA探針標(biāo)識(shí)方法:①5′末端標(biāo)識(shí)法免疫組化與原位雜交第42頁②RNA體外轉(zhuǎn)錄法三、mRNA原位雜交(非放射性探針)基本程序一）標(biāo)本制備免疫組化與原位雜交第43頁1.組織標(biāo)本取材取材標(biāo)準(zhǔn):盡可能快切取所需組織浸入固定液,保持組織新鮮以最大程度地預(yù)防細(xì)胞內(nèi)mRNA或DNA降解,有條件最好在冷庫取材。2.固定固定液用量應(yīng)是標(biāo)本40倍。1)慣用固定劑

①單純固定劑4%多聚甲醛:慣用緩沖中性福馬林:慣用福馬林(10%甲醛水溶液)中性福馬林

②復(fù)合固定劑免疫組化與原位雜交第44頁Bouin氏液：慣用Zamboni氏液：慣用2)固定方法：必須用預(yù)冷（4℃）固定液固定，并保持低溫持

續(xù)固定至所需時(shí)間。

1)灌注固定：最好固定方法，尤其適合用于神經(jīng)組織如腦、脊髓和視網(wǎng)膜。灌注固定后應(yīng)快速切取所需組織，在預(yù)冷固定液中繼續(xù)浸泡固定至所需時(shí)間。2)浸泡固定：最普通和慣用固定方法，適合用于除神經(jīng)組織外各種組織。3.包埋和切片:采取石蠟包埋和切片，切片厚度應(yīng)為4-6um。普通不用冰凍切片，因?yàn)檩p易脫片。4.切片雜交前處理：免疫組化與原位雜交第45頁1)石蠟切片回水：經(jīng)二甲苯、逐層酒精等脫蠟回水。2)去除內(nèi)源性堿性磷酸酶或過氧化物酶活性：切片在0.2N鹽酸0.3%TritonX-100水溶液中浸泡40分鐘以滅活內(nèi)源性堿性磷酸酶，或用0.3%H2O2孵育40分鐘以消耗內(nèi)源性過氧化物酶活性。假如是做FISH,則可省略此步驟。3)暴露mRNA或DNA:加proteinaseK溶液置37℃20分鐘以暴露細(xì)胞mRNA，或微波加熱以暴露細(xì)胞DNA。4)預(yù)雜交處理：加無探針雜交液預(yù)處理切片。此步驟無必要，能夠省略。5)探針雜交:加含探針雜交液置46℃過夜（放在搖床上更加好），以sense和antisense探針互為對照。6)雜交后洗滌：置46℃去離子水洗切片3次，每次15分鐘（放在搖床上洗更加好），以除去未雜交探針。免疫組化與原位雜交第46頁7)雜交信號(hào)檢測：加堿性磷酸酶或過氧化物酶標(biāo)識(shí)羊抗地高辛抗體室溫孵育2小時(shí)，加酶底物NBT/BCIP或DAB顯色。如做FISH則可省略此步驟。8)封片及雜交結(jié)果檢驗(yàn)：普通用水溶性封片劑封片，酶底物顯色標(biāo)本在普通顯微鏡下檢驗(yàn)，F(xiàn)ISH在熒光下檢驗(yàn)。附1：mRNA原位雜交程序1.石蠟切片經(jīng)二甲苯、逐層酒精等脫蠟回水。2.切片在0.2N鹽酸0.3%TritonX-100水溶液中浸泡40分鐘以滅活內(nèi)源性堿性磷酸酶。與此同時(shí)配制10ug/mlProteinaseK溶液（10ugProteinaseK在1mlProteinaseK激活液中）。3.用去離子水洗切片4次，加ProteinaseK溶液置37℃15-20分鐘，免疫組化與原位雜交第47頁無RNase水（DEPC處理）水洗切片4次。4.加雜交液置46℃過夜（放在搖床上更加好）。5.46℃去離子水洗切片3次，每次15分鐘（放在搖床上洗更加好）。6.加堿性磷酸酶