酵母基因工程

酵母基因工程酵母基因工程第1頁基因工程5

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基因工程基礎概念基因工程基礎原理基因工程所需基礎條件基因工程操作過程目標基因克隆與基因文庫構建大腸桿菌基因工程酵母基因工程哺乳動物基因工程高等植物基因工程酵母基因工程第2頁E酵母菌表示系統(tǒng)7酵母基因工程C酵母菌載體系統(tǒng)B酵母菌宿主系統(tǒng)A酵母菌作為表示外源基因受體菌特征F利用重組酵母生產乙肝疫苗D酵母菌轉化系統(tǒng)酵母基因工程第3頁A酵母菌作為表示外源基因受體菌特征7酵母基因工程酵母菌分類學特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖單細胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔子菌綱（擔子酵母菌）、半知菌類（半知酵母菌），共由56個屬和500多個種組成。如果說大腸桿菌是外源基因最成熟原核生物表示系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟真核生物表示系統(tǒng)。酵母基因工程第4頁A酵母菌作為表示外源基因受體菌特征7酵母基因工程酵母菌表示外源基因優(yōu)勢全基因組測序，基因表示調控機理比較清楚，遺傳操作簡便能將外源基因表示產物分泌至培養(yǎng)基中含有原核細菌無法比擬真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、成本低廉不含有特異性病毒、不產內毒素，美國FDA認定為安全基因工程受體系統(tǒng)（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）酵母菌是最簡單真核模式生物酵母基因工程第5頁B酵母菌宿主系統(tǒng)7酵母基因工程提升重組蛋白表示產率突變宿主菌抑制超糖基化作用突變宿主菌降低泛素依賴型蛋白降解作用突變宿主菌廣泛用于外源基因表示酵母宿主菌酵母基因工程第6頁廣泛用于外源基因表示酵母宿主菌當前已廣泛用于外源基因表示和研究酵母菌包含：酵母屬如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克魯維酵母屬如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母屬如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）漢遜酵母屬如多態(tài)漢遜酵母（Hansenulapolymorpha）其中釀酒酵母遺傳學和分子生物學研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表示外源基因最理想。酵母基因工程第7頁提升重組蛋白表示產率突變宿主菌能造成釀酒酵母中重組蛋白產量提升或質量改進突變類型ssc1

改進重組蛋白分泌鈣離子依賴型ATP酶ssc2

提升重組蛋白表示轉錄后加工rgr1

提升重組蛋白表示轉錄水平ose1

提升重組蛋白表示轉錄水平ssc11

改進重組蛋白分泌羧肽酶Yrho-

提升重組蛋白表示轉錄水平突變類型生物效應作用位點酵母基因工程第8頁抑制超糖基化作用突變宿主菌能抑制超糖基化突變類型mnn甘露糖生物合成缺點型alg天門冬酰胺側鏈糖基化缺點型och外側糖鏈添加缺點型突變類型生物效應許多真核生物蛋白質在其天門冬酰胺側鏈上接有寡糖基團，它們經常影響蛋白質生物活性。整個糖單位由糖基關鍵和外側糖鏈兩個別組成。

酵母菌普遍擁有蛋白質糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對異源蛋白糖基化反應極難控制，呈超糖基化傾向，所以超糖基化缺點株非常主要。酵母基因工程第9頁降低泛素依賴型蛋白降解作用突變宿主菌泛素介導蛋白質降解作用蛋白酶體LysHOOCUbiquitin76aa

ubiquitinligaseE3

LysubiquitinligaseE3

Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白酵母基因工程第10頁降低泛素依賴型蛋白降解作用突變宿主菌酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)編碼基因酵母菌共有四個泛素編碼基因：UBI1

編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對數生長久表示穩(wěn)定時關閉UBI2

編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對數生長久表示穩(wěn)定時關閉UBI3

編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）對數生長久表示穩(wěn)定時關閉UBI4

編碼泛素五聚體對數生長久關閉穩(wěn)定時表示酵母菌共有七個泛素連接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7酵母基因工程第11頁降低泛素依賴型蛋白降解作用突變宿主菌泛素降解路徑衰減釀酒酵母在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表示，UBI4-突變株能UBI4缺點型：正常生長，但細胞內游離泛素分子濃度比野生株要低得多，所以UBI4缺點突變株是外源基因表示理想受體UBA1缺點型：UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性，但其等位基因缺點是非致死性，而且也能減弱泛素介導蛋白降解Ubc4-ubc5雙突變型：七個泛素連接酶基因突變對衰減蛋白降解作用一樣有效酵母基因工程第12頁C酵母菌載體系統(tǒng)7酵母基因工程酵母菌克隆表示質粒構建酵母菌中野生型質粒酵母基因工程第13頁酵母菌中野生型質粒釀酒酵母中2m環(huán)狀質粒幾乎全部釀酒酵母中都含有2m雙鏈同源重組REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB環(huán)狀質粒，拷貝數達50至100個。IRs反向重復序列，600bp，重組FLP

編碼產物驅動IRs同源重組REP

編碼產物控制質粒穩(wěn)定性STB

REP結合位點接合酵母屬中pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中pKD1等均與2m質粒類似。酵母基因工程第14頁酵母菌中野生型質粒乳酸克魯維酵母中線狀質粒乳酸克魯維酵母中含有兩種不一樣pGKL18.9kbDNA聚合酶毒素蛋白ab免疫蛋白g亞基雙鏈線狀質粒pGKL1和pGKL1拷貝數為50-100個，分別攜帶K1K2兩種能使各種酵母菌致死毒反向重復序列素蛋白編碼基因（abg），同時含有毒素蛋白抗性基因。酵母基因工程第15頁酵母菌克隆表示質粒構建含有ARSYRp質粒構建ARS為酵母菌中自主復制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個ARS元件。酵母菌自主復制型質粒構建組成包含復制子、標記基因、提供克隆位點大腸桿菌質粒DNA。

以ARS為復制子質粒稱為YRp上述兩類質粒在釀酒酵母中拷貝數最高可達200個，但培養(yǎng)幾代

以2m質粒上復制元件為復制子質粒稱為YEp后，質粒丟失率高達50%-70%，主要是因為分配不均勻所致。酵母基因工程第16頁酵母菌克隆表示質粒構建含有CENYCp質粒構建CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配相關序列將CENDNA插入含ARS質粒中，取得新載體稱為YCpYCp質粒含有較高有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數只有1-5個含有TELYAC質粒構建酵母基因工程第17頁酵母菌克隆表示質粒構建含有酵母菌染色體DNA同源序列YIp質粒構建

在大腸桿菌質粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標識基因，構建出來質粒稱為Yip。目標基因表示盒通常插在染色體DNA特定序列中，這么目標基因就能高效整合入酵母菌特定染色體DNA區(qū)域酵母基因工程第18頁D酵母菌轉化系統(tǒng)7酵母基因工程轉化質粒在酵母細胞中命運酵母菌轉化程序用于轉化子篩選標識基因酵母基因工程第19頁酵母菌轉化程序酵母菌原生質體轉化法

早期酵母菌轉化都采取在等滲緩沖液中穩(wěn)定原生質體轉化法，在Ca2+和PEG存在下，轉化細胞可達原生質體總數1-2%。但該程序操作周期長，而且轉化效率受到原生質再生率嚴重制約原生質體轉化法一個顯著特點是，一個受體細胞可同時接納多個質粒分子，而且這種共轉化原生質體占轉化子總數25-33%酵母基因工程第20頁酵母菌轉化程序堿金屬離子介導酵母菌完整細胞轉化

釀酒酵母完整細胞經堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質粒DNA，而且含有以下特征：吸收線型DNA能力顯著大于環(huán)狀DNA，二者相差80倍共轉化現象極為罕見酵母基因工程第21頁酵母菌轉化程序酵母菌電擊轉化法酵母菌原生質體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質粒DNA，但在此過程中應防止使用PEG，它對受電擊細胞含有較很大負作用。電擊轉化優(yōu)點是不依賴于受體細胞遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉化率可高達105/mgDNA。酵母基因工程第22頁轉化質粒在酵母細胞中命運單雙鏈DNA均可轉化酵母菌，但單鏈轉化率是雙鏈10-30倍含有復制子單鏈質粒進入細胞后，能準確地轉化為雙鏈并復制不含復制子單鏈質粒進入細胞后，能高效地同源整合入染色體這對于體內定點突變酵母基因組極為有利克隆在YIp整合型質粒上外源基因，假如含有受體細胞染色體DNA同源序列，會發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉化子總數50-80%酵母基因工程第23頁用于轉化子篩選標識基因用于酵母菌轉化子篩選標識基因主要有營養(yǎng)缺點型互補基因和顯性基因兩大類

營養(yǎng)缺點型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE

但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺點型受體非常困難營養(yǎng)缺點型互補基因酵母基因工程第24頁用于轉化子篩選標識基因顯性標識基因編碼產物只要是毒性物質抗性蛋白顯性標識基因aph

氨基糖苷轉移酶抗G418cat

氯霉素乙酰轉移酶抗氯霉素dhfr

二氫葉酸還原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1

銅離子螯合物耐受銅離子suc2

蔗糖轉化酶耐受高濃度蔗糖ilv2

乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草劑標識基因編碼產物遺傳表型酵母基因工程第25頁E酵母菌表示系統(tǒng)7酵母基因工程外源基因在酵母菌中表示限制原因酵母菌開啟子可控性酵母菌表示系統(tǒng)選擇酵母基因工程第26頁酵母菌開啟子可控性pho4TS-PHO5開啟子：釀酒酵母PHO5開啟子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時才能打開PHO4基因編碼產物是PHO5開啟子正調控因子所以，裝在pho4TS-PHO5開啟子下游外源基因在35℃時關閉23℃誘導表示溫度控制型開啟子PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS編碼產物在35℃時失活酵母基因工程第27頁酵母菌開啟子可控性a–a型開啟子：釀酒酵母有a和a兩種單倍體，分別由MATa和MATa兩個等位基因決定。a1因子決定a細胞特征表示a2因子阻遏a細胞特征表示a1-a2阻遏a細胞特征表示編碼a2因子基因突變型hmla2-102能產生a2變體，它能滅活a1，同時阻遏a型溫度控制型開啟子a型開啟子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型開啟子受體細胞基因組重組質粒a型開啟子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型開啟子a2a125℃35℃酵母基因工程第28頁酵母菌開啟子可控性釀酒酵母超誘導型開啟子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導效果不顯著，基因基底水平表示GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導時，GAL4高效表示，GAL1、GAL1、GAL10超高效表示GAL10Promoter半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和

GAL10基因編碼酵母基因工程第29頁外源基因在酵母菌中表示限制原因外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA濃度外源基因mRNA翻譯活性酵母菌對密碼子偏愛性在釀酒酵母中，高豐度蛋白質（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上氨基酸是由25個密碼子編碼酵母基因工程第30頁酵母菌表示系統(tǒng)選擇釀酒酵母基因表示系統(tǒng)最為成熟，包含轉錄活性較高甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫釀酒酵母表示系統(tǒng)酶基因ADH所屬開啟子，各種重組外源蛋白取得成功表示。釀酒酵母表示系統(tǒng)最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結合，而不能大量分泌。這一缺點可用非釀酒酵母型表示系統(tǒng)來填補。酵母基因工程第31頁酵母菌表示系統(tǒng)選擇

乳酸克魯維酵母雙鏈環(huán)狀質粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產高效表示穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力條件下，也乳酸克魯維酵母表示系統(tǒng)能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表示分泌型和非分泌型重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表示系統(tǒng)。酵母基因工程第32頁酵母菌表示系統(tǒng)選擇巴斯德畢赤酵母是一個甲基營養(yǎng)菌，能在低廉甲醇培養(yǎng)基中生巴斯德畢赤酵母表示系統(tǒng)長，甲醇可高效誘導甲醇代謝路徑中各酶編碼基因表示，所以生長快速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬強開啟子、表示可誘導性是巴斯德畢赤酵母表示系統(tǒng)三大優(yōu)勢。因為巴斯德畢赤酵母沒有適當自主復制型載體，所以外源基因表示序列普通整合入受體染色體DNA上。在此情況下，外源基因含有經濟價值重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中取得成功表示。高效表示在很大程度上取決于整合拷貝數多寡。當前已經有20余種酵母基因工程第33頁酵母菌表示系統(tǒng)選擇多型漢遜酵母也是一個甲基營養(yǎng)菌。其自主復制序列HARS已被多型漢遜酵母表示系統(tǒng)克隆，并用于構建克隆表示載體，但與巴斯德畢赤酵母相同，這種載體在受體細胞有絲分裂時顯示出不穩(wěn)定性。所不一樣是，HARS質粒能高頻自發(fā)地整合在受體染色體DNA上，甚至能夠連續(xù)整合100多當前，包含乙型肝炎表面抗原在內數種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲個拷貝，所以重組多型漢遜酵母構建也是采取整合策略。得成功表示。酵母基因工程第34頁F利用重組酵母生產乙肝疫苗7酵母基因工程由乙型肝炎病毒（HBV）感染引發(fā)急慢性乙型肝炎是一個嚴重傳染病，每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當一個別人可能轉化為肝硬化或肝癌患者。當前對乙型肝炎病毒還沒有一個有效治療藥品，所以高純度乙型疫苗生產對預防病毒感染含有重大社會效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產乙型疫苗為其廣泛應用提供了可靠確保。酵母基因工程第35頁F利用重組酵母生產乙肝疫苗7酵母基因工程產乙肝表面抗原重組釀酒酵母乙型肝炎病毒結構與性質產乙肝表面抗原重組巴斯德畢赤酵母酵母基因工程第36頁乙型肝炎病毒結構與性質

乙肝病毒是一個蛋白包裹型雙鏈DNA病毒，含有感染力病毒乙型肝炎病毒結構顆粒呈球面狀，直徑為42nm，基因組僅為3.2kb。病毒顆粒主要結構蛋白是病毒表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它含有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內蛋白成份包含關鍵抗原（HBcAg）、除此之外，被乙肝病毒感染人肝臟還能合成并釋放大量22病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。nm空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是未裝配各種包裝蛋白組份1000倍。包裝蛋白共有三種轉膜糖蛋白：S、M、L多肽。酵母基因工程第37頁乙型肝炎病毒結構與性質乙型肝炎病毒包裝蛋白編碼基因ATGATGATGTAA108aa55aa226aapreS1preS2SS多肽226aaM多肽281aaL多肽399aa酵母基因工程第38頁乙型肝炎病毒結構與性質

乙肝病毒在體外細胞培養(yǎng)基