流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析

流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第1頁流式細(xì)胞儀（FlowCytometer）是集各種技術(shù)為一體新型高科技儀器。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第2頁流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測伎倆，對(duì)處于快速直線流動(dòng)狀態(tài)中細(xì)胞或生物顆粒同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選高新技術(shù)。研究對(duì)象：各種細(xì)胞、微生物、人工合成微球等。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第3頁BDFACSAria流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第4頁中心試驗(yàn)室流式能做什么？流式試驗(yàn)需要做哪些準(zhǔn)備和工作？流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第5頁流式細(xì)胞儀檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞功效細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿百分比DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析特異性抗原（細(xì)胞表面/胞漿/核）細(xì)胞活性細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體凋亡在上述信號(hào)基礎(chǔ)上細(xì)胞分選（未開展分選）流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第6頁

單細(xì)胞標(biāo)本制備標(biāo)識(shí)熒光抗體檢測（老師）數(shù)據(jù)分析FCM實(shí)驗(yàn)流程流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第7頁一、單細(xì)胞標(biāo)本制備

（關(guān)鍵步驟）流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第8頁6種標(biāo)本起源①外周血單細(xì)胞懸液制備新鮮外周血是天然單細(xì)胞懸液，需要用紅細(xì)胞裂解液裂解RBC。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第9頁②

培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液制備

流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第10頁③

脫落細(xì)胞單細(xì)胞懸液制備脫落細(xì)胞應(yīng)去除取材伴隨雜質(zhì)后再制備細(xì)胞懸液。對(duì)臨床診療和治療很有意義，比如脫落肺泡細(xì)胞。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第11頁

④

新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備常見方法：酶消化法、機(jī)械法、化學(xué)處理法、表面活性劑處理法等。不論哪種方法都不可防止會(huì)對(duì)細(xì)胞表面膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞活性和功效造成不一樣程度損傷。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第12頁⑤活檢標(biāo)本單細(xì)胞懸液制備方法：與新鮮實(shí)體組織基礎(chǔ)相同，要求鏡檢取材標(biāo)本最少取3塊以上。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第13頁⑥

石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液制備常見方法：二甲苯脫蠟法、組織清潔劑脫蠟法、甲氧-雙氧水處理法。擴(kuò)充了流式應(yīng)用范圍，有利于進(jìn)行臨床回顧性研究。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第14頁評(píng)判單細(xì)胞懸液制備標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞團(tuán)塊、碎片盡可能少，不能出現(xiàn)肉眼可見團(tuán)塊，上機(jī)前細(xì)胞必須過300目濾膜。細(xì)胞呈單個(gè)分散狀態(tài)。細(xì)胞濃度：5×105~1×106分散過程中細(xì)胞活性不受到顯著損害，以確保下一步熒光染色處理。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第15頁

樣品制備過程中常見問題及處理對(duì)策

常見問題原因處理對(duì)策細(xì)胞密度低制備過程中細(xì)胞損失增加離心時(shí)間、吸棄上清非特異熒光強(qiáng)抗體不純、死亡細(xì)胞多選擇純度高抗體、用同型對(duì)照抗體或雙標(biāo)識(shí)排除非特異熒光碎片多細(xì)胞死亡、機(jī)械損傷在細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)測試、防止重復(fù)吹打細(xì)胞聚集消化不完全、酒精固定造成細(xì)胞粘連徹底消化、在用酒精固定細(xì)胞時(shí)加入終濃度為1.5-3％小牛血清熒光弱靈敏度不夠、抗體加入量不飽和、反應(yīng)時(shí)間短改用生物素-親和素、增加抗體用量、延長反應(yīng)時(shí)間測不出亞二倍體峰凋亡測試方法選擇不妥改用原位末端標(biāo)識(shí)或Annexin-V和PI雙標(biāo)識(shí)法流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第16頁二、標(biāo)識(shí)熒光抗體流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第17頁

直接免疫熒光染色：細(xì)胞與抗體反應(yīng)，多用于細(xì)胞表面標(biāo)志染色分析。間接免疫熒光染色：先用一抗與待測抗原反應(yīng)，再用二抗（熒光素標(biāo)識(shí)）進(jìn)行標(biāo)識(shí)。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第18頁選擇適當(dāng)熒光染料必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配置激光器所激發(fā)。（激發(fā)光源488nm\633nm\407nm）激發(fā)光譜必須在儀器上濾光片能夠接收適當(dāng)范圍。熒光素光譜重合應(yīng)該盡可能降低。一定要選擇商業(yè)化流式用單克隆抗體，這類抗體在制備過程中有嚴(yán)格質(zhì)控，非特異熒光弱。最好用直標(biāo)抗體，假如是用間標(biāo)抗體，二抗選擇更應(yīng)嚴(yán)格。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第19頁影響熒光染色效果原因溫度：高溫時(shí)熒光淬滅可能性增大。pH值：其改變會(huì)造成熒光光譜改變，影響熒光強(qiáng)度。固定劑：與細(xì)胞一些物質(zhì)結(jié)合后，干擾熒光染料與細(xì)胞成份結(jié)合，造成熒光強(qiáng)度改變。其它：孵育時(shí)間、溶劑性質(zhì)、細(xì)胞濃度等。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第20頁三、上機(jī)檢測（老師）設(shè)門畫圖電壓調(diào)整熒光賠償樣本搜集儀器維護(hù)和質(zhì)控流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第21頁舉例1采樣軟件流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第22頁舉例2單參數(shù)直方圖流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)方法及常見問題分析第23頁舉例3點(diǎn)圖流式細(xì)