細胞自噬與腫瘤專家講座

細胞自噬與腫瘤細胞自噬與腫瘤專家講座第1頁一、自噬介紹

二、自噬研究方法

三、自噬與腫瘤關(guān)系

目錄細胞自噬與腫瘤專家講座第2頁一、自噬介紹1.1自噬過程(1)在饑餓、氧化應(yīng)激損傷等情況下，自噬體膜脫落形成杯狀分隔膜，包繞在被降解物周圍；

(2)分隔膜逐步延伸，將要被降解胞漿成份完全包繞形成雙層膜自噬體；

(3)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體并降解其內(nèi)成份，自噬體膜脫落再循環(huán)利用。

細胞自噬與腫瘤專家講座第3頁自噬過程

2.1自噬功效：（1）對外源性刺激適應(yīng)性反應(yīng)；（2）細胞保持穩(wěn)定狀態(tài)管家機制；（3）參加一定組織特異性融合；（4）作為一個細胞死亡程序誘導(dǎo)細胞主動性死亡。細胞自噬與腫瘤專家講座第4頁自噬發(fā)生過程分子機制

細胞自噬與腫瘤專家講座第5頁自噬研究方法

當前普遍采取自噬檢測方法包含電鏡、免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡等方法檢測自噬體及其標志蛋白。準確評定自噬不但包含自噬體檢測，還包含動態(tài)觀察整個自噬性降解過程是否順暢(即自噬潮分析)。另外，經(jīng)過藥品或基因干預(yù)技術(shù)來人為地調(diào)控自噬以觀察其在體內(nèi)體外模型中作用也是自噬分析主要內(nèi)容。

任何一個方法單獨應(yīng)用均不能作為自噬依據(jù)，不能將自噬體增多降低或自噬相關(guān)蛋白表示高低等同于自噬增強或減弱[1]。細胞自噬與腫瘤專家講座第6頁1、自噬性結(jié)構(gòu)電鏡下形態(tài)學(xué)觀察

透射電子顯微鏡是觀察自噬現(xiàn)象最直接、最經(jīng)典方法。電鏡檢測自噬主要是基于識別自噬體結(jié)構(gòu)。

電鏡觀察僅能證實自噬性結(jié)構(gòu)存在，難以反應(yīng)自噬活性強弱。Swanlund等[2]介紹了一個免疫金電鏡技術(shù)來對電鏡結(jié)果進行定量分析。經(jīng)過圖像分析軟件自動測量全部自噬囊泡面積(μm2)，假如一個細胞胞漿中被自噬性囊泡所占據(jù)總面積增加，則可說明自噬機制上調(diào)。細胞自噬與腫瘤專家講座第7頁細胞自噬與腫瘤專家講座第8頁2、基于自噬體標識蛋白LC3檢測方法

自噬過程由一系列自噬相關(guān)蛋白(Atg蛋白)介導(dǎo)完成，這些蛋白質(zhì)在自噬體形成不一樣階段發(fā)揮作用.。細胞內(nèi)存在兩種形式LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。當自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺(PE)偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜。LC3-Ⅱ一直穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，所以被用來作為自噬體標識。細胞自噬與腫瘤專家講座第9頁2.1、

細胞免疫熒光LC3-Ⅰ在胞漿內(nèi)彌散分布，LC3-Ⅱ聚集于自噬體膜上，經(jīng)過免疫熒光方法檢測內(nèi)源性LC3或轉(zhuǎn)染GFP-LC3融合蛋白表示，自噬誘導(dǎo)后細胞表現(xiàn)為點狀聚集增多。理論上，觀察到點狀聚集數(shù)目即為自噬體數(shù)量，依據(jù)點狀聚集密集程度能夠判斷細胞自噬情況。不過這種方法僅從總體上大致反應(yīng)自噬增加或降低，定量分析則存在不足。細胞自噬與腫瘤專家講座第10頁

GFP-LC3單熒光自噬指示體系：

綠色斑點增多也并不一定代表自噬活性增強，也有可能是自噬溶酶體降解路徑受阻，能夠經(jīng)過westernblot檢測游離GFP、p62來驗證。細胞自噬與腫瘤專家講座第11頁2.2、LC3蛋白轉(zhuǎn)化

試驗自噬發(fā)生后，經(jīng)過Western-blot能夠檢測到兩個條帶蛋白質(zhì)。因為在自噬時細胞內(nèi)LC3蛋白總表示水平其實并無上調(diào)，僅僅是一部分LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變成了LC3-Ⅱ，那么理論上自噬時應(yīng)表現(xiàn)為LC3-Ⅰ降低和LC3-Ⅱ增加，經(jīng)過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ或者LC3-Ⅱ/(LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ)即可反應(yīng)自噬水平。細胞自噬與腫瘤專家講座第12頁

不過因為二者反抗體結(jié)合能力差異造成檢測敏感性不一樣(LC3-Ⅱ檢測敏感性高于LC3-Ⅰ)，實際檢測結(jié)果LC3-Ⅰ降低并不與LC3-Ⅱ增加同時，所以單純比較LC3-Ⅱ蛋白水平可能更加好。細胞自噬與腫瘤專家講座第13頁3、

基于自噬性降解檢測———“自噬潮”分析自噬過程是動態(tài)改變，想要說明細胞自噬活性強弱，必須通觀整個自噬過程是否順利，即經(jīng)過基于自噬性降解自噬潮分析來深入說明自噬活性。

自噬潮涵蓋了自噬體形成、自噬性底物向溶酶體運輸以及在溶酶體內(nèi)降解整個過程。顯然，對這整個過程進行監(jiān)測比單純自噬體檢測更能反應(yīng)自噬活性，所以“自噬潮”分析是反應(yīng)自噬活性可靠指標。細胞自噬與腫瘤專家講座第14頁3.1、長壽命蛋白降解依據(jù)自噬機制主要負責降解長壽命蛋白特征，先讓細胞在含有同位素標識氨基酸培養(yǎng)基中生長一段時間，細胞在此期間合成蛋白質(zhì)都將被同位素標識，然后換成不含同位素培養(yǎng)基，讓一些被標識短壽命蛋白經(jīng)過蛋白酶體路徑降解。

在自噬誘導(dǎo)后，經(jīng)過檢測培養(yǎng)基上清中釋放自噬性降解產(chǎn)物放射性活度即可反應(yīng)細胞自噬性降解能力。細胞自噬與腫瘤專家講座第15頁3.2、LC3和其它自噬性底物降解自噬過程中，自噬體內(nèi)膜上LC3-Ⅱ被溶酶體降解，經(jīng)過免疫印跡監(jiān)測自噬過程中LC3蛋白量改變或流式細胞儀監(jiān)測GFP-LC3熒光強度改變即可反應(yīng)自噬活性。在自噬誘導(dǎo)一開始，GFP-LC3點狀聚集顯著增多，隨即信號可能會出現(xiàn)下降，代表著自噬性降解發(fā)生。細胞自噬與腫瘤專家講座第16頁3.3、mRFP-GFP-LC3溶酶體呈遞mRFP-GFP-LC3雙熒光自噬指示體系：細胞自噬與腫瘤專家講座第17頁3.4、GFP-LC3切割LC3連同自噬體內(nèi)膜和內(nèi)容物一起被溶酶體降解，但GFP在溶酶體中僅表現(xiàn)熒光信號猝滅，GFP本身并不被降解，在自噬性溶酶體降解后會釋放出游離GFP。

經(jīng)過免疫印跡方法檢測游離GFP蛋白出現(xiàn)即意味著自噬性降解發(fā)生。細胞自噬與腫瘤專家講座第18頁4、自噬試驗性調(diào)控經(jīng)過人為干預(yù)來激活或者抑制自噬功效后觀察細胞行為或效應(yīng)分子改變能夠使研究結(jié)論更含有說服力。當前，試驗性激活或者抑制自噬方法有藥品處理、自噬基因敲除、緘默或過表示。

慣用自噬激活劑：雷他霉素、營養(yǎng)缺乏、Lithum

慣用自噬抑制劑：3-MA、氯化銨、BafilomycinA1細胞自噬與腫瘤專家講座第19頁自噬與腫瘤關(guān)系自噬在腫瘤治療中有雙重作用：作為腫瘤抑制機制，自噬能夠造成細胞死亡、限制細胞數(shù)量，或者降低DNA突變概率，以預(yù)防腫瘤形成；作為腫瘤保護機制，自噬能夠保護癌細胞免受化療藥品作用并延緩腫瘤細胞凋亡[3]。

自噬能夠抑制腫瘤，比如葡萄籽原花青素誘導(dǎo)肝癌細胞自噬性死亡[4]，硅膠納米顆粒經(jīng)過活性氧誘導(dǎo)細胞自噬及自噬性死亡[5]。另外，有研究顯示，在各種應(yīng)激情況下，自噬能夠提升細胞存活[6]。比如，腫瘤進展造成局部缺氧和營養(yǎng)匱乏，此時自噬水平升高以增加腫瘤細胞存活[7]。細胞自噬與腫瘤專家講座第20頁參考文件[1]馬泰,孫國平,李家斌.細胞自噬研究方法[J].生物化學(xué)與生物物理進展,,39(3):204-209.[2]ChenN,Karantza-WadsworthV.Roleandregulationofautophagyincancer[J].BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-MolecularCellResearch,,1793(9):1516-1523.[3]石文沽,劉凱,陳德喜,等.自噬與肝癌[J].北京醫(yī)學(xué),,33(12).[4]王威,陳景紅,王新寧,等.葡萄籽原花青素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細胞凋亡及自噬性死亡[J].暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版),,32(2).[5]SharmaV,AndersonD,DhawanA.ZincoxidenanoparticlesinduceoxidativeDNAdamageandROS-triggeredmitochondriamediatedapoptosisinhumanlivercells(HepG2)[J].Apoptosis,,17(8):852-870.[6]KroemerG,Mari?oG,LevineB.Autophagyandtheintegratedstressresponse[J].Molecularcell,,4