蛋白質的相互作用研究方法

蛋白質的相互作用研究方法第1頁/共37頁

蛋白質－蛋白質相互作用和識別在諸如生物催化、物質轉運、信號傳導、免疫、細胞調控等多種生命過程起著重要的作用。第2頁/共37頁第三節(jié)蛋白質的相互作用的研究方法免疫共沉淀Co-immunoprecipitation(Co-IP)GSTpull-downassay熒光共振能量轉移FluorescentResonantEnergyTransfer（FRET）雙分子熒光互補（BimolecularFluorescentComplement）BIFC酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwo-HybridSysterm其它方法第3頁/共37頁1.原理

當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合，也可用于確定一種特定蛋白質的新的結合蛋白。優(yōu)點：生理條件下的結合缺點：可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用一、免疫共沉淀第4頁/共37頁2.方法1)收獲培養(yǎng)的細胞（1×107－1×108）冷PBS洗滌2次2）細胞裂解液裂解細胞，冰浴30min3)12000rpm離心30min4）收集上清并加入適量抗體，4oC搖動1h～過夜5）加入ProteinA/G-Sepharose(瓊脂糖凝膠)懸液，4oC搖動1h6）細胞裂解液洗滌ProteinA/G-Sepharose混合液7）離心棄上清8）沉淀加2×蛋白LoadingBuffer煮沸5－10min9）離心，上清液跑SDS膠10）考馬氏亮蘭染色、銀染

WesternBlot質譜分析第5頁/共37頁3.注意事項1）細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的蛋白質－蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中要加各種蛋白酶酶抑制劑，如商品化的cocktailer。2）使用明確的抗體，有的抗體不適宜做免疫共沉淀。3)對照實驗的設計。第6頁/共37頁二、GST融合蛋白進行Pulldow實驗

1原理細菌表達的谷胱甘肽s－轉移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結合，然后根據谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標蛋白的抗體前，或發(fā)現抗體干擾蛋白質－蛋白質之間的相互作用時，可以啟用GST沉降技術。該方法只是用于確定體外的相互作用。

兩種應用：

1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用

2）證實探針蛋白與已知蛋白質間可疑的相互作用

第7頁/共37頁2方法：

1）GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a,單一明確的重組蛋白；b，細胞裂解蛋白混合液；c,體外翻譯cDNA表達得到的未知蛋白）

2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應4oC2h3）離心棄上清

4）沉淀加入2×

蛋白LoadingBuffer煮沸，離心

5）取上清進行SDS電泳，

6）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進一步做質譜分析確定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做WesternBlot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：該實驗設立GST對照，反應均在4oC進行第8頁/共37頁GST-PulldownAssay第9頁/共37頁三、Fluorescenceresonanceenergytransfer熒光信號的產生

熒光基團在某波長的激發(fā)光刺激下，產生一個更長波長的發(fā)射光。第10頁/共37頁什么是FRET?

當某個熒光基團的發(fā)射譜與另一熒光基團的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，這個過程稱為熒光共振能量轉移(FRET),實際相當于將短波長熒光基團釋放的熒光屏蔽。第11頁/共37頁3.綠色熒光蛋白

60年代，Shimomura等首先從水母（AequoriaVictoria

）中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結合后可產生藍色熒光。然而水母中提取的顆粒都呈綠色，后經證實在水母體內還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白GFP,

后經研究表明，在水母體內Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結合后，水母發(fā)光蛋白產生藍色熒光，GFP在藍光的激發(fā)下，產生綠色熒光。第12頁/共37頁OsamuShimomura

OsamuShimomurainthelabinthebasementofhishome.Heisholdingasampleof“real”GFPisolatedfromAequoreavictorea,notproducedbybacteria.

InordertodohisresearchShimomuraestimatesthathecollectedoveramillionAequoreaspecimens。（OneAequoreaweighabout50g）第13頁/共37頁WilliamWard(right)metDouglasPrasheronajellyfish-huntingexpeditioninthe1980s

DouglasPrasherwasthefirstpersontorealizethepotentialofGFPasatracermolecule.GFPcouldbeusedtoreportwhenaproteinwasbeingmadeinacell.GFPcouldpotentiallybeaveryusefulreportermolecule.容易檢測分子量小不需要其它底物DouglasPrasher1992克隆了GFP基因第14頁/共37頁第15頁/共37頁Chalfie將GFP基因轉入大腸桿菌中。第16頁/共37頁SergeyA.Lukyanov在珊瑚中發(fā)現了類似GFP的蛋白。他還發(fā)現了紅色熒光蛋白。第17頁/共37頁RogerTsien對GFP的機理作出了貢獻。制造了很多GFP突變體。第18頁/共37頁GFPsequenceMSKGEELFTGVVPVLVELDGDVNGQKFSVSGEGEGDATYGKLTLNFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFYKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKMEYNYNSHNVYIMGDKPKNGIKVNFKIRHNIKDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMILLEFVTAARITHGMDELYK/2001/07/26/0726gfp_print.html/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm第19頁/共37頁第20頁/共37頁2008年諾貝爾化學獎第21頁/共37頁GFP主要應用:

對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態(tài)觀察

可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時空表達,如某種轉錄因子的核轉位、蛋白激酶C的膜轉位等。

GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉染細胞,可動態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細胞外的過程

GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細胞中細胞核、內質網、高爾基體、線粒體等細胞器的結構及病理過程。膜蛋白的移動（FluorescenceRecoveryAfterPhotobleachingFRAP）蛋白之間的相互作用（FRET）報告分子將GFP的基因連在特殊的啟動子的后面，可以檢測基因表達的時間和部位。第22頁/共37頁

人們在GFP基因的基礎上已經制造出藍色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，青色熒光蛋白，又發(fā)現了紅色熒光蛋白。其中蘭色熒光蛋白和綠色熒光蛋白青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白之間可以發(fā)生熒光共振能量轉移第23頁/共37頁Lookatphysicalinteractionsbetweenproteins第24頁/共37頁四、BimolecularFluorescentComplementation第25頁/共37頁第26頁/共37頁五、YeastTwo－HybridSysterm第27頁/共37頁1.原理酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉錄調控中建立。典型的真核生長轉錄因子，如GAL4、GCN4、等都含有二個不同的結構域:DNA結合結構域(DNA-bindingdomain)和轉錄激活結構域(transcription-activatingdomain)。前者可識別DNA上的特異序列，并使轉錄激活結構域定位于所調節(jié)的基因的上游，轉錄激活結構域可同轉錄復合體的其他成分作用，啟動它所調節(jié)的基因的轉錄。

第28頁/共37頁

根據這一特點，如果使可能存在相互作用的兩種蛋白X和Y分別以和BD/AD形成雜合蛋白的形式的酵母中表達分布于細胞核中，X與Y之間的相互作用就可以將BD和AD在空間結構上重新聯(lián)結為一個整體而與報告基因的上游激活序列（upstreamactivationsequence）結合，進而發(fā)揮激活轉錄的功能，使受調控的報告基因得到表達。根據這一原理，雙雜交系統(tǒng)通過簡便的酵母遺傳分析對報告基因表型進行檢測即可實現對于蛋白質間相互作用的研究。

第29頁/共37頁第30頁/共37頁

酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報告基因的表達探測蛋白－蛋白的相互作用。主要有二類載體:a含DNA-bindingdomain的載體;b含Transcription-activatingdomain的載體。另外還需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。1）兩種蛋白之間是否有相互作用2）尋找一種蛋白可能的相互作用蛋白2.應用

第31頁/共37頁（1）它并非對所有蛋白質適用。

融合蛋白的相互作用激活報告基因轉錄是在細胞核內發(fā)生的，而表達的融合蛋白在細胞內能否正確折疊并運至核內是檢測的前提條件。雖然目前已經在表達質粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必須經過內質網等細胞器進行翻譯后加工修飾的蛋白質尤其是胞外蛋白不能進入核內，或因產生錯誤的構象而影響篩查結果.3.雙雜交系統(tǒng)的缺陷

第32頁/共37頁

（2）假陽性的發(fā)生較為繁多。在篩庫過程中遇到的假陽性可被簡單分成三型：Ⅰ型：表達單獨的AD-Y融合蛋白即可激活轉錄。Ⅱ型：表達AD-Y融合蛋白和空BD載體即可激活轉錄。Ⅲ型：表達AD-Y融合蛋白與任意BD融合蛋白即可激活轉錄。3.雙雜交系統(tǒng)的缺陷

第33頁/共37頁（3）在某些酵母菌株中大量表達外源蛋白質常會帶來毒性作用，從而影響菌株生長及報告基因的表型。為了抑制背景表達而在培養(yǎng)其中添加的3-AT（3-Aminotriazole)或6-Azauracil也對菌株有一定毒性，使一些蛋白質間較弱的相互作用可能會因此而被掩蓋。（4）還應意識到的一點