蛋白互作研究方法

蛋白互作研究方法第1頁/共51頁1研究蛋白質(zhì)相互作用的意義

隨著生命現(xiàn)象的研究逐漸由獲取基因序列信息轉(zhuǎn)向研究基因功能,一門新的學科———蛋白質(zhì)組學proteomics應運而生。蛋白質(zhì)組是一個在空間和時間上動態(tài)變化的整體,其功能往往是通過蛋白質(zhì)之間或與核酸之間相互作用而表現(xiàn)出來的,這種相互作用存在于機體每個細胞的生命活動過程中,相互交叉形成網(wǎng)絡,構成細胞中一系列重要生理活動的基礎。因此,對于蛋白質(zhì)相互作用interactome的研究就成為蛋白質(zhì)組學中最主要研究內(nèi)容之一。第2頁/共51頁2蛋白質(zhì)相互作用常用研究方法1酵母雙雜交(Yeasttwo-hybrid,Y2H)2pull-down3免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)4雙分子熒光互補技術(Biomolecularfluorescencecomplementation,BiFCorSplitYFP)5Far-westernanalysis第3頁/共51頁3酵母雙雜交技術3.1原理DNA-bindingandactivatingfunctionsinatranscriptionfactormaycompriseindependentdomainsoftheprotein.第4頁/共51頁ThetwohybridtechniqueteststheabilityoftwoproteinstointeractbyincorporatingthemintohybridproteinswhereonehasaDNA-bindingdomainandtheotherhasatranscription-activatingdomain.

第5頁/共51頁3.2酵母雙雜交文庫構建與篩選BDMatchmaker?LibraryConstruction&ScreeningKits第6頁/共51頁誘餌蛋白載體構建第7頁/共51頁第8頁/共51頁pGADT7-RecVectorInformation第9頁/共51頁文庫構建第10頁/共51頁第11頁/共51頁ConstructingADfusionlibrariesbyrecombination-mediatedcloninginyeast.第12頁/共51頁cDNAlibraryofoilseedrapelineRS-1constructedinyeast第13頁/共51頁Yeastcellsthataremating.Azygotetypicallyhasthree-lobedshape,thelobesrepresentingthetwohaploid(parental)cellsandthebuddingdiploidcells.Libraryscreeningbymating第14頁/共51頁PositiveclonesconfirmedonSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal第15頁/共51頁檢測特定兩個蛋白是否互作第16頁/共51頁pGADT7VectorInformation第17頁/共51頁3.3膜蛋白互作研究方法－－－基于泛素的酵母雙雜交體系(mating-basedSplitubiquitinsystem"mbSUS“)1）GAL4體系的缺點2)MbSUS體系第18頁/共51頁mbSUS原理第19頁/共51頁第20頁/共51頁InvivocloningintombSUSvectorsGATEWAYcloningmethod第21頁/共51頁第22頁/共51頁第23頁/共51頁第24頁/共51頁第25頁/共51頁第26頁/共51頁第27頁/共51頁第28頁/共51頁4pulldown1)原理第29頁/共51頁第30頁/共51頁2)試劑盒第31頁/共51頁TheMagneGST.Pull-DownSystem第32頁/共51頁Figure1.OverviewoftheMagneGST.Pull-DownSystemprotocol.P=PreyProtein,M=MagneGST.Particle.第33頁/共51頁5免疫共沉淀Co-IP第34頁/共51頁第35頁/共51頁第36頁/共51頁6Far-westernanalysis第37頁/共51頁

雙分子熒光互補(bimolecularfluorescencecomplementation，BiFC)分析技術，利用綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)及其突變體(YFP,CFP,BFP)的特性作為報告基因，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接.如果兩個目標蛋白因為有相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團而發(fā)出熒光.在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時間、位置、強弱、所形成蛋白質(zhì)復合體的穩(wěn)定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響等，這些信息對研究蛋白質(zhì)相互作用有一定意義。7雙分子熒光互補技術BiFC第38頁/共51頁PrincipleoftheBiFCassay第39頁/共51頁GFP的特性綠色熒光蛋白(GFP)來源于水母(Aequoreavictoria)，分子質(zhì)量約為27kda，能在各種細胞中表達.受到激發(fā)時，不需要任何輔助因子，就能在活體中發(fā)出綠色熒光.1992年，Prasher等[2]克隆了GFP基因.隨后，GFP作為一種研究基因表達和蛋白質(zhì)定位的活體可遺傳標記，在各種類型細胞的研究中得到了廣泛的應用.第40頁/共51頁GFP的一些定點突變能明顯地改變其波長性質(zhì).產(chǎn)生的突變體,具有產(chǎn)生多色光的特性，如：GFP66

位的酪氨酸突變?yōu)樯彼岷蟪蔀榍嗌珶晒獾鞍?cyanfluorescenceprotein，CFP)，203位的蘇氨酸突變?yōu)槔野彼岷蟪牲S色熒光蛋白(yellowfluorescenceprotein，YFP)，145位酪氨酸突變?yōu)楸奖彼岷蟪伤{色熒光蛋白(bluefluorescenceprotein，BFP)[3].2002年Hu等[1]最先報道了用BiFC技術在活細胞中觀察bZIP和Rel家族蛋白的相互作用，利用的就是YFP作標記，在熒光顯微鏡下用525nm波長直接檢測黃色熒光.第41頁/共51頁GFP及其各種突變體的片段互補特性第42頁/共51頁Visualizationofproteininteractionsinlivingplantcellsusingbimolecularfluorescencecomplementation第43頁/共51頁Detectionofprotein–proteininteractionsinplantsusingbimolecularfluorescencecomplementationDepartmentofPlantSciences,TelAvivUniversity,TelAviv69978,Israel第44頁/共51頁Confocalimagesofbimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)studies第45頁/共51頁