分子發(fā)光分析法講義

分子發(fā)光分析法講義第1頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日基態(tài)分子吸收了一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài)。當(dāng)激發(fā)態(tài)分子以輻射躍遷形式將其能量釋放返回基態(tài)時(shí)，便產(chǎn)生分子發(fā)光。

化學(xué)發(fā)光Chemiluminescence場(chǎng)致發(fā)光熱致發(fā)光光致發(fā)光Photoluminescent

磷光Phosphorescence

熒光Fluorescence第2頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日§5-1熒光分析法分子熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的分子熒光光譜進(jìn)行定性，以熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量的一種分析方法。一、基本原理：（一）、分子熒光（磷光）的產(chǎn)生：室溫下，大多數(shù)分子處在基態(tài)的最低振動(dòng)能層。處于基態(tài)的分子吸收能量（電能、熱能、化學(xué)能或光能）后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)。若返回到基態(tài)時(shí)伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光”。第3頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日單重態(tài)，激發(fā)單重態(tài)，三重態(tài)：

第4頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

去活化過(guò)程：處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它可能通過(guò)輻射躍遷和非輻射躍遷等去活化過(guò)程返回基態(tài)。由較高能態(tài)到較低能態(tài)的過(guò)程()

其中，以速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)。

E*E0第5頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日化學(xué)反應(yīng)非輻射躍遷發(fā)射光子去活化過(guò)程內(nèi)轉(zhuǎn)換ic外轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫VR體系間竄躍isc熒光F——熒光（單重—單重，停10-9-10-6s）磷光P——磷光（三重—單重，停10-4-10s）第6頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日去活化過(guò)程：

⑴、振動(dòng)馳豫（VR）在同一能級(jí)中，分子由較高振動(dòng)能級(jí)向該電子態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的非輻射躍遷。其速率極大，10-14~10-12s內(nèi)即可完成。

⑵、內(nèi)轉(zhuǎn)換（ic）指相同多重態(tài)的兩個(gè)電子態(tài)之間（S2S1，S1S0）的非輻射躍遷。當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非?？拷灾疗湔駝?dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，常發(fā)生電子由高能級(jí)以無(wú)輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級(jí)。如圖中S2的較低振動(dòng)層與S1的較高振動(dòng)層相重疊，分子無(wú)論在哪一個(gè)激發(fā)單重態(tài)，都能通過(guò)振動(dòng)馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化躍回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。第7頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日λ1λ2λ312V=03S0V=01S221V=0S12ic2VRiscFP1V=0T1VRiciscFP第8頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日（3）、體系間竄躍（isc）指不同多重態(tài)的兩個(gè)電子之間的非輻射躍遷。它涉及受激發(fā)電子自旋狀態(tài)的改變，如S1T1，使原來(lái)兩個(gè)自旋配對(duì)的電子不再配對(duì)，這種躍遷是禁阻躍遷。含有重原子（碘、溴等）的分子中，體系間跨越躍遷最為常見(jiàn)。在溶液中存在如氧分子等順磁性物質(zhì)也能增加體系間跨越的發(fā)生，因而使熒光減弱。第9頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

4）、熒光發(fā)射（Fluorescence）

當(dāng)分子處于單重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)時(shí)，去活化過(guò)程的一種形式是以10-9~10-6s左右的短時(shí)間發(fā)射一個(gè)光子返回基態(tài)。這一過(guò)程稱為熒光發(fā)射。（單重—單重，停10-9——10-6s）

發(fā)射熒光的能量比分子所吸收的能量要小，即熒光的特征波長(zhǎng)比它所吸收的特征波長(zhǎng)要長(zhǎng)。注意：基態(tài)中也有振動(dòng)馳豫躍遷。λ3＞λ1或λ2

，不論電子開始被激發(fā)至什么高能級(jí)，最終將只發(fā)射出波長(zhǎng)為λ3的熒光。第10頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日（5）、磷光發(fā)射（Phosphorescence）從單重態(tài)到三重態(tài)的分子體系間竄躍發(fā)生后，接著發(fā)生快速的振動(dòng)馳豫而到達(dá)三重態(tài)的最低能層上，此時(shí)可能由兩種途徑返回基態(tài)：①體系間竄躍②在10-4~10s左右時(shí)間內(nèi)輻射躍遷回基態(tài)而發(fā)生磷光.這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。（三重—單重，停10-4-10s，液氮冷凍試樣，才可見(jiàn)磷光）熒光和磷光的根本區(qū)別:

熒光是由單重-單重躍遷引起的，磷光則由三重-單重躍遷產(chǎn)生的。

第11頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日觀察磷光現(xiàn)象時(shí)，試樣要用液氮冷凍

a.三重態(tài)與基態(tài)之間的能量差要比最低激發(fā)態(tài)和基態(tài)之間的能量差小，這使三重態(tài)與基態(tài)之間的振動(dòng)偶合增強(qiáng)，因而增強(qiáng)了內(nèi)部轉(zhuǎn)換；

b.激發(fā)三重態(tài)的壽命比激發(fā)單重態(tài)的壽命長(zhǎng)，因而同溶劑分子碰撞而失去激發(fā)能的可能性增大，以致在室溫條件下不能觀察到溶液的磷光。因此，觀察磷光現(xiàn)象時(shí)，試樣要用液氮冷凍以使碰撞去活化和振動(dòng)偶合去活化降至最低限度?第12頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日λ1λ2λ312V=03S0V=01S221V=0S12ic2VRiscFP1V=0T1VRiciscFP第13頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

1、激發(fā)光譜：熒光和磷光都是光致發(fā)光，因此必須選擇合適的激發(fā)光波長(zhǎng)，這可從他們的激發(fā)光譜曲線來(lái)確定以熒光（磷光）的最大發(fā)射波長(zhǎng)為測(cè)量波長(zhǎng)，改變激發(fā)光的波長(zhǎng)，測(cè)量熒光強(qiáng)度的變化，以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫座標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)作圖，即可得到激發(fā)光譜。相對(duì)強(qiáng)度

ⅢⅡⅠ萘的激發(fā)光譜Ⅰ

熒光光譜Ⅱ

磷光光譜Ⅲ相對(duì)強(qiáng)度λ200300400500相對(duì)強(qiáng)度第14頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

熒光或磷光光譜曲線:固定激發(fā)光波長(zhǎng)為其最大激發(fā)波長(zhǎng)，然后測(cè)定不同的波長(zhǎng)時(shí)所發(fā)射的熒光或磷光強(qiáng)度，將熒光的光波長(zhǎng)為橫座標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)作圖便可得到熒光光譜（發(fā)射光譜）。第15頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日2、激發(fā)光譜和熒光光譜的特點(diǎn)：（1）熒光光譜的形狀與激發(fā)光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)熒光物質(zhì)吸收不同波長(zhǎng)的激發(fā)光可被激發(fā)到不同能態(tài)，通過(guò)振動(dòng)馳豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)換最終都將達(dá)到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后再發(fā)射熒光。故蒽的激發(fā)光譜雖在250nm和350nm有兩個(gè)峰，不論用哪一個(gè)峰的波長(zhǎng)作激發(fā)光源，所得熒光光譜的形狀和峰的位置都是相同的。第16頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日（2）熒光光譜和激發(fā)光譜成鏡像關(guān)系從圖可看出激發(fā)光譜同熒光光譜大致成鏡像對(duì)稱

a.熒光光譜(發(fā)射光譜）形狀與基態(tài)S0振動(dòng)能級(jí)的分布情況（即能量間隔情況）有關(guān)

b.激發(fā)光譜(吸收譜)形狀與激發(fā)態(tài)S1振動(dòng)能級(jí)的分布有關(guān)第17頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日c.S0、、S1態(tài)中振動(dòng)能級(jí)的分布是相似的(說(shuō)明峰形狀相似）d.根據(jù)Frankcondon原理，電子躍遷過(guò)程中核的相對(duì)位置不變（近似的），若吸收光譜中某一振動(dòng)帶的躍遷幾率最大，則在熒光發(fā)射光譜中，其相反躍遷的幾率也應(yīng)最大(說(shuō)明高峰對(duì)高峰，低峰對(duì)低峰）非鏡像對(duì)稱的峰出現(xiàn)，則表示有散射光或雜質(zhì)存在。第18頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日（3）熒光光譜波長(zhǎng)λem大于激發(fā)光譜波長(zhǎng)λex

斯托克斯（Stokes）于1852年首次觀察到熒光光譜波長(zhǎng)λem大于激發(fā)光譜波長(zhǎng)λex這一現(xiàn)象（稱斯托克斯位移）。它說(shuō)明激發(fā)與發(fā)射間有一定能量損失。產(chǎn)生的主要原因是激發(fā)態(tài)分子發(fā)射前后都存在振動(dòng)弛豫現(xiàn)象。第19頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日例:

區(qū)別譜圖中的三個(gè)峰，說(shuō)明判斷原則。第20頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日（三）、熒光效率及其影響因素：

1、分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件：⑴、分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光；⑵、吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率（熒光效率）第21頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日⑴、熒光效率熒光效率越高，輻射躍遷概率就越大，物質(zhì)發(fā)射的熒光也就越強(qiáng)。⑵、熒光效率也可用各種躍遷的速率常數(shù)來(lái)表示

Kf：表示熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)，主要取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；：表示非輻射躍遷的速率常數(shù)之和，主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。2、熒光效率第22頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日3、熒光效率的影響因素：

⑴、分子結(jié)構(gòu)：

a、躍遷類型：實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)熒光化合物都是由π→π*或n→π*躍遷激發(fā)，然后經(jīng)過(guò)VR或其它無(wú)輻射躍遷，再發(fā)生π*

→π或π*

→n躍遷而產(chǎn)生熒光。其中π→π*躍遷的熒光效率較高。

原因：的ε較大（比n大100-1000倍），其次，壽命約10-7—10-9s(比n壽命10-5—10-7s短)，此外，在過(guò)程中，體系間竄躍至三重態(tài)的速率常數(shù)也較小，這都有利于熒光的發(fā)射。第23頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日b、共軛效應(yīng)：含有π→π*躍遷能級(jí)的芳香族化合物的熒光最強(qiáng)；這種體系中的π電子共軛度越大，則π電子的離域性越強(qiáng)，越易被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，而且熒光光譜將向長(zhǎng)波移動(dòng)。所以絕大多數(shù)能發(fā)生熒光的物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán)。對(duì)苯基化、間苯基化和乙烯化作用都將增加苯的熒光強(qiáng)度，并使熒光光譜紅移。第24頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日c、剛性平面結(jié)構(gòu)：此結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減小，也就減少了碰撞去活的可能性，有利于熒光的產(chǎn)生。

例1：熒光素有很強(qiáng)熒光，但酚酞無(wú)，是由于熒光素的剛性可減少分子振動(dòng)第25頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日例2：芴和聯(lián)苯在同樣條件下的熒光效率約為1.0和0.2。芴上的亞甲基增強(qiáng)了分子的剛性。此外，當(dāng)熒光染料吸附在固體表面上時(shí)，常使熒光發(fā)射增強(qiáng)，這可用固體表面誘導(dǎo)了分子結(jié)構(gòu)的附加剛性來(lái)說(shuō)明。第26頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日例3：剛性的影響可說(shuō)明螯合劑同M螯合時(shí)熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象。

滂鉻蘭黑R（BBR）無(wú)熒光，它與鋁形成螯合物有熒光。第27頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日d、取代基效應(yīng)：①給電子取代基使共軛體系增大，使熒光增強(qiáng)，如

—OH，—NH2，—NR2，—OR，—CN。②吸電子取代基使熒光減弱甚至?xí)鐭晒猓?/p>

—COOH，—NO，—NO2，—C=O，鹵素離子等。③

同π電子體系相互作用小的取代基（—SO3H，

—NH3+和烷基），對(duì)分子發(fā)光影響小。④重原子效應(yīng)：將一高原子序數(shù)的原子引入到π電子體系中去，往往會(huì)使物質(zhì)的熒光減弱，而磷光增強(qiáng)。第28頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日重原子效應(yīng)：若使用含重原子的溶劑，也會(huì)發(fā)生外部重原子效應(yīng)，導(dǎo)致磷光增強(qiáng)和熒光減弱。如鹵素取代基熒光的相對(duì)強(qiáng)度氟代苯10

氯代苯7

溴代苯5

碘代苯0

原因：因?yàn)樵谠有驍?shù)高的原子中，電子自旋和軌道運(yùn)動(dòng)間的相互作用變大，更有利于電子自旋的改變，增大了體系間竄躍，而使熒光減弱，磷光增強(qiáng)。第29頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日⑵、環(huán)境因素：A、溶劑的極性：極性增加，對(duì)激發(fā)態(tài)會(huì)產(chǎn)生更大的穩(wěn)定作用，結(jié)果使物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)紅移，熒光強(qiáng)度增大。B、溫度：輻射躍遷的速率基本不隨溫度而變；非輻射躍遷的速率隨溫度升高而顯著地增大；因此，升高溫度會(huì)使非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。C、pH值：影響酸性、堿性取代基團(tuán)的存在型體，應(yīng)嚴(yán)格控制pH。如苯胺在pH=7~12時(shí)以分子型體存在，發(fā)蘭色熒光，而pH小于2、pH大于13時(shí)以離子形式存在，不發(fā)生熒光。D、表面活性劑：增大熒光效率E、順磁性物質(zhì)：減小熒光效率如O2。第30頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

（四）熒光強(qiáng)度同濃度的關(guān)系1、熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率。If=Ia據(jù)Beer定律：Ia=I0-It=I0(1-10-A)代入上式得：If=I0(1-10-A)=I0(1-10-bc)若溶液很稀(A＜0.05），則可近似為If=2.3I0bc對(duì)于一給定的物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度一定時(shí)，熒光強(qiáng)度只與溶液濃度有關(guān)。

If=Kc

熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比第31頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日2、高濃度偏離線性關(guān)系的因素：a.當(dāng)濃度較濃，不滿足A＜0.05，公式近似處理誤差大（如果a=104，b=1.0代入abc＜0.05得c=5.0×10-6mol/L)b.自猝滅（Self-quenching）由熒光分子間以及熒光分子同溶劑分子間的碰撞產(chǎn)生的。c↑，自猝滅↑。c.自吸收（Self-absorption）發(fā)生在熒光發(fā)射波長(zhǎng)同化合物的吸收峰重迭的情況下，當(dāng)熒光通過(guò)溶液時(shí)便被吸收一部分。第32頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日3、影響熒光強(qiáng)度的因素：內(nèi)濾光作用和自吸收現(xiàn)象：溶液中若存在著能吸收激發(fā)或熒光物質(zhì)所發(fā)射光能的物質(zhì)，就會(huì)使熒光減弱。熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)一端與該物質(zhì)的吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)一端有重疊，在溶液濃度較大時(shí)，一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產(chǎn)生“自吸收”現(xiàn)象而降低了溶液的熒光強(qiáng)度。第33頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日熒光猝滅（熒光熄滅）：

廣義的說(shuō)，指任何可使物質(zhì)熒光強(qiáng)度下降的作用，任何可使熒光強(qiáng)度不與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系的作用，或任何可使熒光量子產(chǎn)率降低的作用。狹義的說(shuō)，指熒光分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的物理或化學(xué)作用過(guò)程。熒光猝滅劑：與熒光物質(zhì)分子發(fā)生相互作用而引起熒光強(qiáng)度下降的物質(zhì)。第34頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日(1).動(dòng)態(tài)猝滅

猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生的相互作用過(guò)程(能量轉(zhuǎn)移過(guò)程等），可生成瞬時(shí)激發(fā)態(tài)復(fù)合物（不發(fā)射熒光，或熒光的發(fā)射特性與原先的熒光物質(zhì)不同），從而引起熒光猝滅現(xiàn)象。動(dòng)態(tài)猝滅的效率受熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子的壽命和猝滅劑的濃度限制。

1-萘胺的熒光在堿性溶液中發(fā)生猝滅現(xiàn)象，但它的吸收光譜并無(wú)變化，這是動(dòng)態(tài)猝滅的一個(gè)例子。

第35頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日(2).靜態(tài)猝滅

猝滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)發(fā)生配合反應(yīng)，降低了熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。動(dòng)態(tài)猝滅中的熒光量子產(chǎn)率由光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)控制，靜態(tài)猝滅中的熒光量子產(chǎn)率只受基態(tài)的配位作用的熱力學(xué)所控制。第36頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日(3).猝滅劑

氧能使多數(shù)熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光猝滅現(xiàn)象。

胺類是大多數(shù)未取代的芳烴的有效猝滅劑。

鹵素化合物、重金屬離子以及硝基化合物等，也是常見(jiàn)的猝滅劑。鹵素離子對(duì)奎寧有顯著的猝滅作用。但對(duì)某些物質(zhì)卻無(wú)猝滅作用。這表明猝滅劑和熒光物質(zhì)分子之間的相互作用是有一定選擇性的。第37頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日(4)自猝滅：當(dāng)熒光物質(zhì)濃度超過(guò)1g/L時(shí)，常發(fā)生熒光的自猝滅（濃度猝滅）現(xiàn)象?？赡艿脑颍篴.熒光輻射的自吸收，這在熒光物質(zhì)的吸收光譜和發(fā)射光譜有較大重疊時(shí)較嚴(yán)重。b.熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子M*與基態(tài)分子M形成激發(fā)態(tài)的二聚體（M*M）。c.基態(tài)的熒光物質(zhì)分子的締合。熒光自猝滅是與濃度有關(guān)的效應(yīng)，因而通過(guò)在熒光測(cè)定前稀釋溶液的辦法，可避免這一現(xiàn)象的發(fā)生，或減小它所產(chǎn)生的影響。第38頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日二、熒光分析儀器示意圖激發(fā)單色器液槽發(fā)射單色器檢測(cè)器記錄儀IfI0II’光源第39頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日1、與分光光度計(jì)的差別：⑴、熒光分析儀器采用垂直測(cè)量方式；⑵、熒光分析儀器有兩個(gè)單色器，一個(gè)是激發(fā)單色器，置于液槽前，用于獲得單色性較好的激發(fā)光；另一個(gè)是發(fā)射單色器，置于液槽和檢測(cè)器之間，用于分出某一波長(zhǎng)的熒光。2、儀器各部分簡(jiǎn)介：光源激發(fā)單色器液槽發(fā)射單色器檢測(cè)器記錄儀第40頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日激發(fā)光源——

作用：提供連續(xù)輻射，激發(fā)樣品要求：光源（I0）強(qiáng)度足夠；強(qiáng)度與波長(zhǎng)無(wú)關(guān)種類：鹵鎢燈，高壓汞燈，氙弧燈。激發(fā)單色器----

作用：用于選擇激發(fā)光的波長(zhǎng)第41頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日樣品池

用石英制成形狀:正方形、長(zhǎng)方形、圓形的。低溫測(cè)定時(shí)在石英液槽外套一個(gè)盛放液氮的透明石英真空瓶。發(fā)射單色器

用于選擇投射到檢測(cè)器的熒光波長(zhǎng)。檢測(cè)器

熒光或磷光的強(qiáng)度較弱，要求檢測(cè)器靈敏度高。光電管，光電倍增管第42頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日三、熒光分析方法及應(yīng)用

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法

用已知的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過(guò)和試樣同樣的處理后，配成一系列標(biāo)液。測(cè)定標(biāo)液的熒光強(qiáng)度，用熒光強(qiáng)度對(duì)標(biāo)液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)試液的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。第43頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日2.熒光分析法的靈敏度：比吸光法高得多，更適合于低濃度物質(zhì)的分子。

這兩種方法在靈敏度方面的差別主要是由于同濃度相關(guān)的參數(shù)的測(cè)量方式不同。

在光度計(jì)中，同濃度相關(guān)的參數(shù)A是I0/I的對(duì)數(shù)。在測(cè)低濃度液時(shí)，檢測(cè)器必須能區(qū)分I、I0訊號(hào)的微小差別，故在低A時(shí)測(cè)量的精確度迅速降低。第44頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日而熒光強(qiáng)度F（或磷光強(qiáng)度P）直接同熒光（磷光）物質(zhì)的濃度成正比。同濃度相關(guān)的參數(shù)是在很小噪聲背景上的熒光（磷光）發(fā)射訊號(hào)本身，可用增強(qiáng)入射光強(qiáng)度I0或增大熒光訊號(hào)的放大倍數(shù)來(lái)提高靈敏度。而在光度法中,若檢測(cè)器放大倍數(shù)↑，I0及I同時(shí)↑，A值不變。

故熒光法靈敏度常比相應(yīng)光度法高2-4個(gè)數(shù)量級(jí)。第45頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

3.

熒光分析法的選擇性

很多分子在紫外可見(jiàn)區(qū)有吸收，但其中只有一部分能再發(fā)射熒光或磷光，故熒光法固有干擾很少，選擇性較好。4．熒光分析法的應(yīng)用第46頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日§5–3磷光分析法

一、概述

磷光的產(chǎn)生涉及到激發(fā)單重態(tài)至激發(fā)三重態(tài)和由激發(fā)三重態(tài)經(jīng)禁阻躍遷回到基態(tài)，易受其它輻射或無(wú)輻射躍遷的干擾而使磷光強(qiáng)度減弱，甚至完全消失。因此，為獲得較強(qiáng)磷光，宜采取下列措施：

1、增加試樣的剛性—可減小質(zhì)點(diǎn)間的碰撞幾率，以減小無(wú)輻射躍遷。低溫磷光就是基于這一原理建立起來(lái)的。通常，將被分析試樣的乙醚或異戊醇溶液置于液氮中（或用二乙醚，異戊烷和乙醇按5：5：2混合稱EPA混合溶劑），讓其冷凍至玻璃狀態(tài)后，即可測(cè)定磷光。

第47頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日2、室溫磷光：固體磷光法

在薄層色譜板上分析斑點(diǎn)磷光，可將被分析物質(zhì)直接固定在薄層色譜板上，而將任何液體溶劑除去。理想的載體應(yīng)是既能將分析物牢固地束縛在表面或基體中以增強(qiáng)磷光強(qiáng)度，本身又不產(chǎn)生背景。常用的是濾紙和纖維素色層紙。分子締合物的形成

在試液中，表面活性劑與被測(cè)物形成膠束締合物后，可增強(qiáng)其剛性，減小因碰撞而引起的能量損失。例表面活性劑十二烷基硫酸鹽和重原子存在下，可測(cè)10-6~10-7mol的萘、芘和聯(lián)苯，精密度達(dá)6%第48頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日3、重原子效應(yīng)在含重原子的溶劑（碘乙烷和溴乙烷）中，有利于體系間跨躍，磷光增強(qiáng)。另外，還可用Ag+鹽、Pb2+鹽和Tl+鹽等重原子鹽類。

第49頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

磷光光度計(jì)由光源，激發(fā)光單色器、液槽、發(fā)射光單色器、檢測(cè)器等組成。二、磷光分析儀器第50頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日1、液槽：為在低溫下測(cè)磷光，液槽（一個(gè)直徑為1mm左右的石英管）需放在充有液氮的石英制的小杜瓦瓶中。常用的溶劑是按5：5：2比例混合的二乙醚，異戊烷和乙醇的混合物，稱EPA混合溶劑。當(dāng)它在液氮中冷凍后成為透明的玻璃狀物質(zhì)。第51頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日2、磷光鏡

由于發(fā)生磷光的物質(zhì)常伴隨有熒光產(chǎn)生，為了區(qū)別磷光和熒光，在激發(fā)光單色器和液槽之間以及在液槽和發(fā)射光單色器之間各裝一個(gè)斬波片，并由一個(gè)同步電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)。這兩個(gè)斬波片可調(diào)節(jié)為同相或異相。同相時(shí)，磷光和熒光一起進(jìn)入發(fā)射光單色器，測(cè)到的是磷光和熒光的總光強(qiáng)。當(dāng)斬波片調(diào)節(jié)為異相時(shí)，激發(fā)光被遮斷。此時(shí)，由于熒光的壽命短，立即消失，而磷光壽命長(zhǎng)，測(cè)到的僅為磷光。第52頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

利用斬波片，不僅可分別測(cè)出磷光和熒光，而且可通過(guò)調(diào)節(jié)兩個(gè)斬波片的轉(zhuǎn)速，測(cè)出不同壽命的磷光。這種具有時(shí)間分辨功能的裝置，是磷光光度計(jì)的一個(gè)特點(diǎn)。美國(guó)P—E公司生產(chǎn)的LS—5和LS—3型發(fā)光光度計(jì)可用于測(cè)定熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光。第53頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日三、分析方法及應(yīng)用

一般與熒光分析法相同，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。與熒光分析法相似，磷光分析法在有機(jī)、生物、醫(yī)藥及臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域中得到了應(yīng)用。它與熒光法相互補(bǔ)充，成為痕量有機(jī)分析的重要手段。

第54頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日§5-4化學(xué)發(fā)光分析法一、概述：某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，由于吸收了反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，便發(fā)出一定波長(zhǎng)的光。這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過(guò)程稱為化學(xué)發(fā)光。利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而建立起來(lái)的分析方法稱為化學(xué)發(fā)光分析法?；瘜W(xué)發(fā)光也發(fā)生于生命體系，這種發(fā)光稱為生物發(fā)光。第55頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理1、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件：化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)所發(fā)射的光。任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都應(yīng)包括化學(xué)激發(fā)和發(fā)光兩個(gè)步驟，必須滿足如下條件：（1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來(lái)源于反應(yīng)焓。大多數(shù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)為氧化還原反應(yīng)。（2）要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程，使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)。對(duì)于有機(jī)分子的液相化學(xué)發(fā)光來(lái)說(shuō)，容易生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的常是芳香族化合物和羰基化合物（3）激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個(gè)分子，而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子的形式回到基態(tài)。第56頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日2、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率cl

又稱化學(xué)發(fā)光的總量子產(chǎn)率。它決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率ce和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率em。定義為

cl=發(fā)射光子的分子數(shù)/參加反應(yīng)的分子數(shù)=ceem

化學(xué)反應(yīng)的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由參加反應(yīng)物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)所決定。每個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都有其特征的化學(xué)發(fā)光光譜及不同的化學(xué)發(fā)光效率。

第57頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日3、化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度Icl

以單位時(shí)間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)表示。它與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的速率有關(guān)，而反應(yīng)速率又與反應(yīng)分子濃度有關(guān)。即

Icl

（t）=cl

dc/dt

式中Icl（t）表示t時(shí)刻的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，是與分析物有關(guān)的化學(xué)發(fā)光效率；dc/dt是分析物參加反應(yīng)的速率。

發(fā)光強(qiáng)度Icl與分析物濃度成正比第58頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型1.直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光

直接發(fā)光是被測(cè)物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。A+BC*+DC*C+h式中A或B是被測(cè)物，通過(guò)反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*，當(dāng)C*躍遷回基態(tài)時(shí)，輻射光子。第59頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

間接發(fā)光是被測(cè)物A或B，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*，C*不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F，使F躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。A+BC*+DC*+FF*+EF*F+h式中C*為能量給予體，而F為能量接受體第60頁(yè)，共68頁(yè)，2023年，2月20日，星期日

2.氣相化學(xué)發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光按反應(yīng)體系的狀態(tài)分類，如化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在氣相中進(jìn)行稱為氣相化學(xué)發(fā)光；在液相或固相中進(jìn)行稱為液相或固相化學(xué)發(fā)光；在兩個(gè)不同相中進(jìn)行則稱為異相化學(xué)發(fā)光。（1）氣相化學(xué)發(fā)光主要有O3、NO、S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測(cè)空氣中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2