黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶

黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶前言：α-粉酶能隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖芽糖、糊精等還原糖，所得產(chǎn)物的還原性末端葡萄糖單位碳原子為構(gòu)型，同時該酶能使淀粉漿的粘度下降，因此又稱為液化酶。耐酸性α-淀粉酶是在酸性條件下水解粉的酶類，其最適pH在4.0左右。自從日本研究者等用黑曲霉生產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶以來各國都對耐性-淀粉酶進(jìn)行了研究。通過黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶的實驗過程，熟悉發(fā)酵罐的構(gòu)和使用方法。初步了解發(fā)酵生產(chǎn)的原理和常規(guī)發(fā)酵參數(shù)的檢測方法。整個實驗按菌種的培養(yǎng)

空消

實消接種

發(fā)酵

放罐的酵過程進(jìn)行。在整個酵的過程中，每隔6h取一次發(fā)酵液樣品檢測其、酶活、殘?zhí)橇考吧锪克膫€生理指標(biāo)。最后將所測數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，可以得出整個發(fā)酵過程各物質(zhì)的生成和消耗的變化規(guī)律以及如何調(diào)整培養(yǎng)條件來提高發(fā)酵生產(chǎn)的效率，對大工業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。正文：

實驗?zāi)康模私獍l(fā)酵罐的幾大系統(tǒng)組成，即空氣系統(tǒng)、蒸汽系統(tǒng)、補(bǔ)料系統(tǒng)、進(jìn)出料系統(tǒng)、度系統(tǒng)、在線控制系統(tǒng)。．掌握發(fā)酵罐空消的具體方法及步驟．掌握發(fā)酵罐進(jìn)料及實消的具體方法及步驟．掌握發(fā)酵罐各系統(tǒng)的控制操作方法

實驗原理蒸系統(tǒng)：蒸汽發(fā)生器：主要用于滅菌，分為自動加水和手動加水兩種方式。溫系統(tǒng)：夾套升溫：蒸汽通入夾。夾套降溫：冷水通入夾套，下進(jìn)水，上出水。發(fā)酵過程自動控溫系統(tǒng)空系統(tǒng)：空氣除菌設(shè)備：空壓機(jī)

貯氣罐

油水分離器

空氣流量計

空氣過濾器發(fā)酵罐補(bǔ)系統(tǒng)：補(bǔ)加培養(yǎng)基、消泡劑、酸堿等。在控制系統(tǒng)進(jìn)料系統(tǒng)：進(jìn)料口（接種口料口（取樣口）管：包括水流通管道和氣流通管道

2244222442水流通：冷卻用水：水經(jīng)過進(jìn)水管道

發(fā)酵罐夾套

出水口保溫用水：關(guān)閉進(jìn)出水管道閥門（水注滿后）

加熱保溫

進(jìn)入夾套氣流通：蒸汽發(fā)生器

蒸汽管道

空氣過濾器/酵罐進(jìn)入罐內(nèi)空氣：空壓機(jī)

貯氣罐

油水分離器

空氣流量計

空氣過濾器

發(fā)酵罐㈠原則通汽前先關(guān)閉所有閥門．粗過濾器不空消也不實消，要定期處理，所以必須關(guān)閉通向粗過濾器的閥門。．活蒸汽，滅過頭，即尾汽不能關(guān)死，要保證有活蒸汽放出，但不能太大，以免分。．罐體排汽口排汽，并保持罐內(nèi)正壓。．空氣過濾系統(tǒng)只空消，不實消，以免罐中物料沖入過濾器內(nèi)。但空消一結(jié)束，即通入無菌空氣吹干管路并保壓，避免染菌。．進(jìn)蒸汽時順著蒸汽管路開閥門，結(jié)束時逆著進(jìn)路關(guān)閥門，先開尾閥后開主閥，結(jié)時先關(guān)主閥后關(guān)尾閥。．蒸汽一停，即由無菌空氣充入保持罐內(nèi)正壓。㈡空先開啟蒸汽發(fā)生器，自有蒸汽產(chǎn)生并排掉管路中冷凝水后，按以下步驟進(jìn)行：．先關(guān)閉所有閥門，檢查處是否關(guān)緊密封，打開罐上方排氣口。汽進(jìn)空氣系統(tǒng)汽蒸汽過濾→分過濾器論汽走到哪一路得先放尾閥，放出冷凝水，排掉冷空氣，待有蒸汽沖出后調(diào)小，打開主閥。．再進(jìn)罐體：由主路進(jìn)罐，然后通入取料管路，再入補(bǔ)料系統(tǒng)（兩邊）。．罐壓升至所需溫度℃）時開始計時保溫保壓30min保壓方式：）調(diào)節(jié)主汽路進(jìn)汽閥門控進(jìn)汽量；2調(diào)節(jié)排氣口排氣量大小或尾閥放汽量。．結(jié)束空消：）逆著蒸汽進(jìn)路關(guān)，先關(guān)近罐。2同時準(zhǔn)備好壓縮空氣確保蒸汽一停即充入無菌壓縮空氣以維持空氣系統(tǒng)及罐內(nèi)的正壓。近罐空氣閥的尾閥要一直微開啟。注意：空消前應(yīng)檢查夾套中是否殘留了冷水，若有，影響罐體升溫，須自夾套出水口將水放出。㈢種制備：接種黑曲霉于PDA液體培養(yǎng)基中，體搖瓶培養(yǎng)。㈣培基配制、實消發(fā)酵培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉200，檬酸氫二銨g，KH15，0.5g，O0.05，MgSO.7H0.5，加水定容至5LpH5.0消泡劑（植物油mL。

24242242422000關(guān)閉氣路入罐閥汽進(jìn)汽→補(bǔ)料口進(jìn)方法同空消罐壓升至0.12Mpa（121保壓、保溫30分鐘實消結(jié)束。㈤冷接種與發(fā)酵待培養(yǎng)基冷卻至28左右時，在加料口周圍放一圈酒精棉球，點燃，在無菌條件下打開進(jìn)料口，迅速接種。將溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等參數(shù)設(shè)定好后，進(jìn)行發(fā)酵。㈥參數(shù)監(jiān)測每隔取一次樣，檢測其、物量、酶活及殘?zhí)呛康戎笜?biāo)。Ⅰ.pH的定：標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)計后，測定樣品。Ⅱ.生量的測定：每次取20-30mL的發(fā)酵液，先用大離心機(jī)50003-5min)離，收集上清液用來測酶活沉淀用水清幾次后再離心后將所得沉淀放入℃烘箱中（右后其干重，取平均值。Ⅲ.酶：試劑：（1碘液：稱取0.5gI2和5.0gKI研溶解于少量蒸餾水，定容，于褐色試劑瓶內(nèi)保存，避免陽光直射。（2稀碘液：取原碘液1ml稀倍此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用（30.5%淀粉液：稱取干燥過的可溶淀粉0.5克，加5ml緩沖液，攪拌混和，再徐徐傾入毫煮沸的緩沖液中。繼煮沸鐘，冷卻至室溫，定容至100mL。此溶液需要當(dāng)天配制磷緩沖液mol/LKHPOmol/LKH方法：取5ml0.5%的溶性淀粉溶液℃浴中預(yù)熱min然后加入適當(dāng)稀(磷酸鹽稀釋緩沖液)的酶液0.5ml反5min后用5mlH終止反應(yīng)取ml反應(yīng)液與碘顯色，在處光密度。以0.5ml水代替應(yīng)液為空白，以不加酶（同樣體積的緩沖液）管為對即取5ml0.5%的溶性淀粉溶液在40水浴中預(yù)熱10min后入的酸鹽稀釋緩沖液0.5ml應(yīng)5ml0.1mol/LHSO終止反應(yīng)。取0.5反應(yīng)液與碘液顯色活根據(jù)下式計算：酶活力u/ml）(R×50×D，中R分表示對照和反應(yīng)液的光密度D為的稀釋倍數(shù)。調(diào)整D使R在間。確定在40、5min內(nèi)解淀粉的酶量為一個活力單位。Ⅳ.殘量的測定：硫蒽酮法測殘?zhí)呛浚?原理糖類與濃硫酸脫水生成糖醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生顏色物質(zhì)，反應(yīng)后溶液呈藍(lán)

綠色，于620處最大吸收，顯色與多糖含量有性關(guān)系。（2試劑①蒽酮試劑。溶解0.2g蒽于濃硫酸%ml中，當(dāng)日配制試用。具體實驗過程中，應(yīng)視樣品分?jǐn)?shù)多少來準(zhǔn)備蒽酮試劑的配置量。比如實測樣品有5份為了保證結(jié)果的可靠性，安排個份樣品試驗重復(fù)數(shù)為。因為每個試驗點實需要4ml酮試劑，所以至少應(yīng)配置的體積為4×3×50ml。此時還應(yīng)慮預(yù)實驗和實驗差錯所消耗蒽酮試劑量。②標(biāo)準(zhǔn)糖試劑。葡萄糖溶液（可加數(shù)滴甲苯防腐）（3操作及其注意事項分別取g/l葡萄糖溶液，0.200.30，0.60，用蒸餾水補(bǔ)到ml別加入ml蒽試劑迅速進(jìn)入水浴中冷卻管加完后一起浸入沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸開始計時，準(zhǔn)確煮沸1，冷卻后進(jìn)行比色。以光密度為縱坐標(biāo)，糖的含量微克數(shù)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?；蚴褂糜嬎闫鬟M(jìn)行一元回歸得出計算式，以便于計算使用。（4樣品含量測定取糖濃度為50左右的樣品液，一式3份別置于不同試管中，對照加入蒸水，然后給各管加入蒽酮試劑以標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行比色定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度計算含量。色氨酸含量較高的蛋白質(zhì)對顯色反應(yīng)有一定的干擾。此外，試管在加入蒽酮試劑過程中，移液管尖端在留高度對于加入蒽酮試劑的速度影響較大，而且對反應(yīng)產(chǎn)生顏色的深淺都會產(chǎn)生影響。因，實驗操作應(yīng)該注意。㈦數(shù)據(jù)處理

60

東部實驗報告（前料結(jié)果、論等）

西部北部㈧罐體清洗

20:第一季度酶活變化：

第三季度時間（h

612243036424860酶活

12980殘?zhí)呛孔兓簳r間（h）

0612182430364248546066殘?zhí)?.10.64含量41852856912值

時）

0

6

12

18

24

30

36

42

48pH值

4生物量（）時間（h）生物量(g)

06121824303642485460660實驗結(jié)果分析：、a-粉酶的活力總體上是呈上升趨勢，在酵初期，由于菌種的代謝慢，總量少，所以內(nèi)活測定數(shù)值比較小上幅度也較小后由于菌種達(dá)到對數(shù)期和穩(wěn)定期黑曲霉的產(chǎn)酶能力加強(qiáng)，酶活不斷升高，且上升幅度也大大提高體看酶活值的變化是越來越大,開始的一段時間內(nèi)酶活值的變化幅度不大,是因為剛開始黑曲霉接種到發(fā)酵罐里,有一段時間的延滯期,盡時間不長而剛開始黑曲霉的數(shù)量相對于發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的而言畢竟是少的，因此導(dǎo)致曲線開始階段變化較緩慢，以后的時間里黑曲霉大量增殖，數(shù)量增加以后產(chǎn)生的酶量便不斷增加。、糖的變化理論上應(yīng)該是越來越，但是實驗中殘?zhí)堑牟▌颖容^大，歸結(jié)原因可能如下：①驗中所使用的蒽酮和淀粉溶液雖是現(xiàn)配現(xiàn)用，但是由于操作不是很嫻熟，淀粉溶液時間稍長就會出現(xiàn)沉淀，這是結(jié)果波動性變化大的最主要的原因；②作不規(guī)范，稀釋倍數(shù)不合理，也可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)波動性較大、pH值大體上是呈下降趨勢，但變動的幅度不大，這可能是接入的的黑曲霉量較少，以致黑曲霉在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的CO2及性物質(zhì)對培養(yǎng)基的影響較小變幅不大，基本上維持在左，此時是由于黑曲霉在發(fā)酵罐中的延遲效應(yīng)，菌種代謝不旺盛，變化不大，隨后隨著菌種的活化，菌種新陳代謝的旺盛釋放以及糖濃度的降低使得發(fā)酵液的值逐漸下降，發(fā)酵后期，菌種的活力下降，溶液的各理化性質(zhì)趨于穩(wěn)定保持在4.5左。、生物量變化理上其變化是隨著時間的推移而逐漸增加的，但由于取樣后實驗操作的失誤導(dǎo)致結(jié)果的波動性很大。實驗感受：通過本次試驗我們直觀地觀察了微生物發(fā)酵的過程，并有較大的收獲，因為這些操作是在